[發(fā)明專利]日本血吸蟲L-乳酸脫氫酶基因、其編碼蛋白及應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910057437.8
• 申請(qǐng)日: 2009-06-17
• 公開（公告）號(hào): CN101921783A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉鋒;韓澤廣;馮正;胡薇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海人類基因組研究中心
• 主分類號(hào): C12N15/53
• 分類號(hào): C12N15/53;C12N9/04;A61K39/00;A61P33/12;C12Q1/32;C07K16/40;A61K48/00
• 代理公司: 上海浦一知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31211
• 代理人: 高月紅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種日本血吸蟲蛋白，特別是涉及一種日本血吸蟲L-乳酸脫氫酶基因、其編碼蛋白及應(yīng)用。

背景技術(shù)

血吸蟲病由血吸蟲的感染引起，在世界上有76個(gè)國家，受感染者約1.5億。致病的血吸蟲有3種，既日本血吸蟲(Schistosoma?japonicum)，曼氏血吸蟲(S.mansoni)和埃及血吸蟲(S.haematobium)。在我國流行的是日本血吸蟲。血吸蟲病的流行給人民身體健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展都造成巨大的損失，因此，防治血吸蟲病、開發(fā)研制血吸蟲臨床診斷試劑和抗血吸蟲的藥物具有巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

日本血吸蟲作為寄生蟲能在人體和動(dòng)物體內(nèi)存在很多年而不被宿主的免疫機(jī)制殺死，與它的免疫逃避能力有關(guān)。其免疫逃避機(jī)制有抗原模擬、抗原偽裝和免疫調(diào)節(jié)。其中免疫調(diào)節(jié)指的是血吸蟲的蛋白能夠調(diào)節(jié)、干擾(主要是抑制)宿主的免疫系統(tǒng)，使其不能發(fā)揮正常的免疫攻擊效能，從而有利于血吸蟲的生存。

血吸蟲的排泄/分泌抗原(Excretory/Secretory?protein，ESP)就是一類可以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)。這些蛋白來自血吸蟲的表皮和腸道上皮，或者是特化的排泄/分泌器官。血吸蟲各個(gè)蟲期都產(chǎn)生這類蛋白。ESP是潛在藥物靶點(diǎn)和疫苗分子，因?yàn)橐种七@些蛋白可以干擾血吸蟲的免疫逃避機(jī)制從而增強(qiáng)宿主的免疫殺滅功能；ESP是潛在的診斷分子，因?yàn)檫@些蛋白游離于宿主的血液中，可以很方便地用現(xiàn)有手段檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種日本血吸蟲L-乳酸脫氫酶基因、其編碼蛋白及應(yīng)用，該蛋白能成為很好的診斷標(biāo)記分子。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的日本血吸蟲L-乳酸脫氫酶的基因，包括：具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。

所述的SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列編碼具有SEQ?ID?NO.2所示序列的蛋白。

本發(fā)明的日本血吸蟲L-乳酸脫氫酶，包括：

具有SEQ?ID?NO.2所示氨基酸序列的蛋白、或由該蛋白發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白，該蛋白是具有SEQ?ID?NO.1序列編碼的蛋白。

利用蛋白質(zhì)組學(xué)手段，通過直接分析感染動(dòng)物(兔子)的血液，發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲的L-乳酸脫氫酶蛋白(L-lactate?dehydrogenase，LDH，Accession?number：AY814177.1)在宿主血液中也存在，是其ESP的成分之一，表明該蛋白可能在血吸蟲的免疫調(diào)節(jié)、免疫逃避方面發(fā)揮重要作用；這也使它成為很好的診斷標(biāo)記分子。這是國際上首次發(fā)現(xiàn)L-乳酸脫氫酶出現(xiàn)在日本血吸蟲的ESP中。

本發(fā)明的日本血吸蟲L-乳酸脫氫酶作為免疫原，在制備血吸蟲疫苗方面的應(yīng)用；作為潛在的藥物作用靶點(diǎn)，在篩選化學(xué)和其他種類藥物方面的應(yīng)用；作為特異性血吸蟲抗原，在制備抗血吸蟲抗體方面的應(yīng)用；在血清學(xué)診斷方面的應(yīng)用；日本血吸蟲L-乳酸脫氫酶的編碼基因，在基因治療方面的應(yīng)用。

具體實(shí)施方式

一、方法：

1、感染動(dòng)物，制備感染血清

在血吸蟲流行區(qū)中收集自然感染的陽性湖北釘螺(Oncomelania?hupensis?hupensis)，將釘螺浸入水中，加以光照，收集浮在水面上的尾蚴。新西蘭大白兔剃去腹部的毛，露出皮膚；取日本血吸蟲1000條尾蚴，經(jīng)裸露的兔子皮膚感染兔子。收集感染后第42天的動(dòng)物血液，制備血清。

2、感染動(dòng)物血清蛋白的提取

用6倍體積的冷丙酮加入到血清中，沉淀血清中的蛋白，離心收集蛋白沉淀(5000rpm，5分鐘)，溶解沉淀用50mM?Tris-HCl(pH?8.3)，5mM?EDTA，1mM?phenylmethyl?sulfonylfluoride(PMSF)，0.5％sodium?dodecyl?sulfate(SDS)，0.5mM二硫蘇糖醇(DTT)，0.5％SDS，利用超聲波促進(jìn)蛋白溶解。

3、血清蛋白的酶解過程：

血清蛋白混合物加入終濃度10mM?DTT，室溫反應(yīng)30分鐘，再加入終濃度55mM的碘乙酰氨置暗處反應(yīng)15分鐘，用去離子水稀釋5-10倍，按1∶50的體積比例加入修飾的測(cè)序級(jí)牛胰酶，37℃酶解過夜。

4、血清蛋白酶解肽段混合物用強(qiáng)陽離子交換柱(Strong?Cation?Exchange，SCX)進(jìn)行分級(jí)：