[發明專利]日本血吸蟲MF3蛋白基因、其編碼蛋白及應用

無效

• 申請號: 200910057436.3
• 申請日: 2009-06-17
• 公開（公告）號: CN101921767A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發明（設計）人: 韓澤廣;劉鋒;胡薇;馮正
• 申請（專利權）人: 上海人類基因組研究中心
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/435;A61K39/00;A61P33/12;G01N33/68;C07K16/18;A61K48/00
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司 31211
• 代理人: 高月紅

技術領域

本發明涉及一種日本血吸蟲蛋白，特別是涉及一種日本血吸蟲MF3蛋白基因、其編碼蛋白及應用。

背景技術

血吸蟲病由血吸蟲的感染引起，在世界上有76個國家，受感染者約1.5億。致病的血吸蟲有3種，既日本血吸蟲(Schistosoma?japonicum)，曼氏血吸蟲(S.mansoni)和埃及血吸蟲(S.haematobium)。在我國流行的是日本血吸蟲。血吸蟲病的流行給人民身體健康和經濟發展都造成巨大的損失，因此，防治血吸蟲病、開發研制血吸蟲臨床診斷試劑和抗血吸蟲的藥物具有巨大的社會和經濟效益。

日本血吸蟲作為寄生蟲能在人體和動物體內存在很多年而不被宿主的免疫機制殺死，與它的免疫逃避能力有關。其免疫逃避機制有抗原模擬、抗原偽裝和免疫調節。其中免疫調節指的是血吸蟲的蛋白能夠調節、干擾(主要是抑制)宿主的免疫系統，使其不能發揮正常的免疫攻擊效能，從而有利于血吸蟲的生存。

血吸蟲的排泄/分泌抗原(Excretory/Secretory?protein，ESP)就是一類可以發揮免疫調節作用的蛋白質。這些蛋白來自血吸蟲的表皮和腸道上皮，或者是特化的排泄/分泌器官。血吸蟲各個蟲期都產生這類蛋白。ESP是潛在藥物靶點和疫苗分子，因為抑制這些蛋白可以干擾血吸蟲的免疫逃避機制從而增強宿主的免疫殺滅功能；ESP是潛在的診斷分子，因為這些蛋白游離于宿主的血液中，可以很方便地用現有手段檢測。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種日本血吸蟲MF3蛋白基因、其編碼蛋白及應用，該蛋白能成為很好的診斷標記分子。

為解決上述技術問題，本發明的日本血吸蟲MF3蛋白的基因，包括：具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。

所述的SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列編碼具有SEQ?ID?NO.2所示序列的蛋白。

本發明的日本血吸蟲MF3蛋白，包括：

具有SEQ?ID?NO.2所示氨基酸序列的蛋白、或由該蛋白發生一個或多個氨基酸的置換、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白，該蛋白是具有SEQ?ID?NO.1序列編碼的蛋白。

利用蛋白質組學手段，通過直接分析感染動物(兔子)的血液，發現日本血吸蟲的MF3蛋白(Accession?number：AY809998.1)在宿主血液中也存在，是其ESP的成分之一，表明該蛋白可能在血吸蟲的免疫調節、免疫逃避方面發揮重要作用；這也使它成為很好的診斷標記分子。這是國際上首次發現MF3蛋白出現在日本血吸蟲的ESP中。

本發明的日本血吸蟲MF3蛋白作為免疫原，在制備血吸蟲疫苗方面的應用；作為潛在的藥物作用靶點，在篩選化學和其他種類藥物方面的應用；作為特異性血吸蟲抗原，在制備抗血吸蟲抗體方面的應用；在血清學診斷方面的應用；日本血吸蟲MF3蛋白的編碼基因，在基因治療方面的應用。

具體實施方式

一、方法

1、感染動物，制備感染血清

在血吸蟲流行區中收集自然感染的陽性湖北釘螺(Oncomelania?hupensis?hupensis)，將釘螺浸入水中，加以光照，收集浮在水面上的尾蚴。新西蘭大白兔剃去腹部的毛，露出皮膚；取日本血吸蟲1000條尾蚴，經裸露的兔子皮膚感染兔子。收集感染后第42天的動物血液，制備血清。

2、感染動物血清蛋白的提取

用6倍體積的冷丙酮加入到血清中，沉淀血清中的蛋白，離心收集蛋白沉淀(5000rpm，5分鐘)，溶解沉淀用50mM?Tris-HCl(pH?8.3)，5mM?EDTA，1mM?phenylmethyl?sulfonylfluoride(PMSF)，0.5％?sodium?dodecyl?sulfate(SDS)，0.5mM二硫蘇糖醇(DTT)，0.5％SDS，利用超聲波促進蛋白溶解。

3、血清蛋白的酶解過程

血清蛋白混合物加入終濃度10mM?DTT，室溫反應30分鐘，再加入終濃度55mM的碘乙酰氨置暗處反應15分鐘，用去離子水稀釋5-10倍，按1∶50的體積比例加入修飾的測序級牛胰酶，37℃酶解過夜。

4、血清蛋白酶解肽段混合物用強陽離子交換柱(Strong?Cation?Exchange，SCX)進行分級

SCX柱的平衡和清潔：SCX柱在每次使用前，先用高鹽溶液(500mM/25％?ACN，pH?3.0)過柱，然后用(H₂O/25％ACN，pH?3.0)平衡。清洗柱則用高鹽溶液。