[發明專利]一種黑芥子硫酸苷酶的提取方法

無效

• 申請號: 200910056790.4
• 申請日: 2009-08-21
• 公開（公告）號: CN101993862A
• 公開（公告）日: 2011-03-30
• 發明（設計）人: 喬勇進;王海宏;方強;陳召亮
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院作物育種栽培研究所
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 吳林松

技術領域

本發明屬于農業技術領域，涉及植物體內酶的分離純化方法。

背景技術

黑芥子硫苷酸酶，俗稱黑芥子硫苷酸酶(myrosinase，EC3.2.3.1)，廣泛存在于自然界。目前在分屬15個科500多種雙子葉植物中均鑒定到黑芥子硫苷酸酶存在，其中，十字花科作物中黑芥子硫苷酸酶含量較高。

目前，黑芥子硫苷酸酶大多數都是從十字花科蔬菜中提取，其提取方法不僅步驟繁瑣，而且得率相對較低。Jwanny等從蘿卜根中提出了2種黑芥子硫苷酸酶。他們將新鮮根100g(干重：6g)剪碎，5℃下加蒸餾水研磨，組織勻漿用粗棉布過濾，然后4℃離心(13000r/min)，取上清液在4℃用水透析2d，得到酶粗提液。透析液用(NH4)₂SO₄＜鹽析，達到100％飽和度，收集沉淀離心15min。沉淀部分用水溶解，過DAAE-纖維素柱，用含0.1～0.5mol/L的磷酸緩沖液(pH7，10mmol/L)梯度洗脫。收集有活性的酶，再過Sephadex?G-200柱，用檸檬酸納-磷酸緩沖液(pH6，10mmol/L)洗脫，得到了2種黑芥子硫苷酸酶，分別為0.8和0.6mg。該技術方案存在工藝復雜和難以大規模生產的技術缺陷。

中國專利CN101173266，名稱為“固定化黑芥子硫苷酸酶及其制備方法”，該發明涉及固定化黑芥子硫苷酸酶及其制備方法。采用十字花科蔬菜種子，特別是西蘭花種子，在提取黑芥子硫苷酸酶過程中添加甘油、EDTA、DTT保護酶活性；在4℃低溫下操作，完成去雜質獲得酶初提液；在固定化步驟中添加海藻酸鈉，在不影響酶活性的溫度下溶解混合，滴入氯化鈣溶液制成海藻酸鈣小顆粒，用戊二醛溶液處理顆粒，將游離的黑芥子硫苷酸酶固定化。該技術方案主要作為黑芥子硫苷酸酶活性的保護方法，對黑芥子硫苷酸酶的分離純化方法未做詳細研究和說明。

發明內容

為改變現有以十字花科植物為原料提取分離黑芥子硫苷酸酶技術的現狀，針對現有的黑芥子硫苷酸酶提取分離技術缺陷，本發明提供了一種以辣根(拉丁文Armoracia?rusticana?G.M.Sch.)為原料提取黑芥子硫苷酸酶的方法。該方法不僅能簡化繁瑣的提取步驟，而且能夠分離得到活性和純度較高的黑芥子硫苷酸酶。

本發明解決該技術問題所采用的的技術方案是：

①辣根的清洗、切片、預冷

將新鮮辣根，如春栽至第二年十月采收的新鮮辣根的肉質根，洗凈后冷風吹干，切成小片，例如厚度1～2mm，放入超低溫冰箱冷凍處理，例如溫度范圍：-65℃～-70℃。

②勻漿、收集濾液

按辣根切片重量加入1.5-2.5倍重量比的pH為5～7干凈去離子水；較佳的，可按辣根切片重量加入2倍重量比的pH為5～7干凈去離子水，迅速(2min以內)打漿，用壓榨機壓汁，采用3-5層醫用紗布過濾；較佳的，采用4層醫用紗布過濾，收集濾液；使用定性分析濾紙(中速)經過真空抽濾，收集濾液。(真空度的范圍是：-0.1～-0.01Mpa；較佳是-0.01Mpa)

③靜置、沉淀、上清液離心

在3～5℃條件下靜置，較佳的，可在4℃條件下靜置，取上清液進行冷凍離心，棄去沉淀。上清液放在3～5℃條件下冷藏待進行分離純化；較佳的，放在4℃條件下冷藏待進行分離純化。

④丙酮沉淀、離心、純化

取一定體積的上述清液，在3～5℃(4℃較佳)、均勻攪拌的條件下，按體積比V(清液)∶V(丙酮)＝1∶1.5～2.5，加入經過預冷(-20℃放置較佳，可行范圍-30℃至-10℃)的丙酮進行沉淀，沉淀完成后汁液進行離心，收集沉淀；沉淀再用少量，例如5～10ml丙酮懸浮洗滌脫水，再離心，收集沉淀。

⑤冷凍干燥、保存

收集的沉淀經低溫冷凍，真空干燥至恒重，密封保存。

由于采用了上述技術方案，本發明取得的有益效果是：