[發明專利]布氏錐蟲苯丙氨酰tRNA合成酶的制備方法

有效

• 申請號: 200910056686.5
• 申請日: 2009-08-20
• 公開（公告）號: CN101633915A
• 公開（公告）日: 2010-01-27
• 發明（設計）人: 姚瓔;杲光偉;李大偉
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術領域

本發明涉及一種生物技術領域的酶的制備方法，具體是一種布氏錐蟲苯丙氨酰tRNA合成酶的制備方法。

背景技術

布氏錐蟲是一種在撒哈拉以南非洲地區所特有的寄生蟲，當侵入寄主后會引起非洲錐蟲病或昏睡病，每年引起50,000～200,000的死亡。錐蟲主要通過采采蠅叮咬來傳染給人和牲畜，早期主要表現為不舒服和不規律的發熱；如果不及時治療，寄生蟲會侵入中央神經系統，最終導致昏迷并引起死亡。目前市場上存在的藥物都存在著一些缺陷，比如藥物毒性、缺乏胃腸外管理抗藥性等都是需要解決的問題。

近年來，隨著生物化學的大力發展，以及錐蟲基因組序列的陸續破解，為我們尋找新的藥物作用靶點提供了很好的基礎。氨酰tRNA合成酶(aaRS)為蛋白質生物合成過程中的一類關鍵酶，一旦aaRS受到抑制，其相應的tRNA就不能夠結合，進而影響整個翻譯過程。蛋白合成受到抑制，會導致整個細胞處于生長靜息。因此，可以抑制氨酰tRNA合成酶的化合物都可以作為潛在的抗感染劑。目前，僅有一種氨酰tRNA合成酶抑制劑莫匹羅星——異亮氨酰tRNA合成酶(IleRS)抑制劑作為已上市的抗菌劑。因此以氨基酰tRNA合成酶進行藥物設計和篩選，有非常好的前景。苯丙氨酰tRNA合成酶(PheRS)是最大的氨酰tRNA合成酶之一，由α₂β₂四聚體所構成，其表達和純化有很大的難度。

經對現有技術的文獻檢索發現，Nina?Moor在《Protein?Expression?andPurification》(《蛋白表達及純化》)2002年24期第260～267頁發表了題為《Cloning?and?Expression?of?Human?Phenylalanyl-tRNA?Synthetase?inEscherichia?coli：Comparative?Study?of?Purified?Recombinant?Enzymes》(《人苯丙氨酰tRNA合成酶在大腸桿菌中的克隆表達：研究比較純化的重組酶》)，文章中給出了表達純化人類苯丙氨酰tRNA合成酶的方法，但是該方法的表達純化步驟繁瑣，對布氏錐蟲苯丙氨酰tRNA合成酶的表達效率較低。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種布氏錐蟲苯丙氨酰tRNA合成酶的制備方法。本發明構建布氏錐蟲苯丙氨酸tRNA合成酶(PheRS)的重組質粒，表達純化出布氏錐蟲苯丙氨酸tRNA合成酶蛋白。

本發明是通過以下的技術方案實現的，本發明涉及一種布氏錐蟲苯丙氨酰tRNA合成酶的制備方法，包括如下步驟：

步驟一，分別設計引物，擴增布氏錐蟲苯丙氨酸tRNA合成酶的α亞基和β亞基基因；

步驟二，將α亞基和β亞基基因分別克隆到原核表達載體pET21a(+)中，構建pET21a(+)-PheRSα及pET21a(+)-PheRSβ表達載體；

步驟三，擴增α亞基的操縱子，之后將操縱子亞克隆到pET21a(+)-PheRSβ中，形成重組共表達載體pET21a(+)-PheRSαβ；

步驟四，將重組共表達載體pET21a(+)-PheRSαβ轉化大腸桿菌BL21(DE3)RIPL中，IPTG誘導表達；

步驟五，收集裂解后的菌液上清，純化蛋白，得布氏錐蟲苯丙氨酰tRNA合成酶。

步驟一中，擴增α亞基基因的引物為：

上游引物：5’ATGAGTACCATGGAGAACACCATTCT；

下游引物：5’AAAACGCATTAGCTTTGAGTTCC。

步驟一中，擴增β亞基基因的引物為：

上游引物：5’ATGCCAACCCTCGCTGTTGTGCGTGAT；

下游引物：5’CTGGGCAAACTGAACATTCAGCTC。

步驟三中，擴增α亞基基因操縱子的引物序列為：

上游引物：5’GCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAG；

下游引物：5’AGGCAGATCTAGTTATTGCTCAGCG。

步驟五中，所述純化采用親和層析方法。

步驟五中，純化時，用含1M咪唑的洗脫液洗脫親和層析柱。

與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：本發明構建布氏錐蟲苯丙氨酸tRNA合成酶(PheRS)的重組質粒，表達純化出布氏錐蟲苯丙氨酸tRNA合成酶蛋白；本發明的步驟簡單，純化效果好，為抗寄生蟲藥物的篩選奠定了基礎。