[發(fā)明專利]一種構(gòu)建GFOR過表達(dá)質(zhì)粒提高山梨醇產(chǎn)量的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910056639.0
• 申請(qǐng)日: 2009-08-19
• 公開（公告）號(hào): CN101993886A
• 公開（公告）日: 2011-03-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鮑杰;董宏偉;劉長(zhǎng)俊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/74
• 分類號(hào): C12N15/74;C12P7/18;C12R1/01
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【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及山梨醇生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種通過構(gòu)建一個(gè)葡萄糖-果糖氧化還原酶(GFOR)過表達(dá)質(zhì)粒，并在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis?ZM4)中將葡萄糖-果糖氧化還原酶過量表達(dá)，從而增強(qiáng)山梨醇生物催化生產(chǎn)效率及得率的方法。

【背景技術(shù)】

山梨醇是一種存在于許多水果中的多羥基化合物。山梨醇的應(yīng)用范圍很廣，它是一種最具開發(fā)潛力的關(guān)鍵中間體。目前，山梨醇主要是合成維生素C的原料，大約有20％用于生產(chǎn)維生素C；同時(shí)，山梨醇作為甜味劑、保濕劑、軟化劑也被廣泛用于食品工業(yè)、化妝品、藥品的生產(chǎn)。目前較為普遍的生產(chǎn)方法是采用葡萄糖催化加氫法生產(chǎn)山梨醇。

生物法生產(chǎn)山梨醇就目前而言，在能生產(chǎn)山梨醇的微生物中只有運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas?mobilis)具有實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的潛力。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能夠組成型的表達(dá)一種葡萄糖-果糖氧化還原酶(Glucose-Fructose?oxidoreductase，GFOR)。該酶通過緊密結(jié)合的輔酶(NADP)催化葡萄糖氧化為δ-葡萄糖內(nèi)酯并產(chǎn)生1mol的還原力(NADPH)；同時(shí)該酶將NADPH中的電子提供給果糖，完成果糖向山梨醇的轉(zhuǎn)換(見圖1)。而δ-葡萄糖內(nèi)酯會(huì)在該菌株生成的δ-葡萄糖內(nèi)酯酶或者自發(fā)水解的作用下，迅速轉(zhuǎn)化生成葡萄糖酸。由于葡萄糖-果糖氧化還原酶催化反應(yīng)的高度選擇性以及該反應(yīng)條件的溫和性，因此該法不涉及到高壓容器的使用，生成的兩個(gè)產(chǎn)物山梨醇和葡萄糖酸都是重要的化工原料并可分別進(jìn)行回收利用。根據(jù)生物法生產(chǎn)山梨醇的以上優(yōu)點(diǎn)不難看出，利用生物法生產(chǎn)山梨醇的化工過程符合當(dāng)今經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展對(duì)低能耗，低污染工業(yè)技術(shù)的需求，有可能發(fā)展成為現(xiàn)有生產(chǎn)山梨醇的替代技術(shù)。

利用生物法生產(chǎn)山梨醇與其他生物催化法生產(chǎn)化學(xué)品有著共同的一個(gè)特點(diǎn)就是：方便的獲得大量、性質(zhì)穩(wěn)定和廉價(jià)的生物催化劑(酶或細(xì)胞)是決定生物催化過程能否真正用于實(shí)際工業(yè)中的一個(gè)決定因素。根據(jù)以往國(guó)內(nèi)外相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道可知，來源于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的葡萄糖-果糖氧化還原酶具有良好的穩(wěn)定性以及高度的催化選擇性。整個(gè)酶催化反應(yīng)機(jī)理單一，除山梨醇和葡萄糖酸外沒有其他副產(chǎn)物。經(jīng)過大量和長(zhǎng)期的研究，國(guó)內(nèi)外學(xué)者提供了各種經(jīng)濟(jì)可行的細(xì)胞催化反應(yīng)工藝；然而，作為催化劑的GFOR的來源，始終是制約該過程在實(shí)際中得以應(yīng)用的一個(gè)關(guān)鍵瓶頸。國(guó)外曾有許多學(xué)者曾通過將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中編碼GFOR的基因(gfo)進(jìn)行克隆，并將其置于大腸桿菌表達(dá)體系中進(jìn)行過量表達(dá)，以期獲得大量和廉價(jià)的酶制劑(Arch.Microbiol.1996，166，32-41；)。然而，由于編碼GFOR的基因在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中表達(dá)后存在一個(gè)表達(dá)后轉(zhuǎn)運(yùn)以及加工的過程(其具體機(jī)理仍然未見相關(guān)報(bào)道)，因此編碼該酶的基因至今仍然無法在大腸桿菌及其他常見表達(dá)體系中大量表達(dá)出具有活性的產(chǎn)物(J.Bacteriol.1992，174，1439-1447；Structure?1996，4，1413-1428；Eur.J.Biochem.1997，244，107-112)；GFOR的來源仍然僅限于從運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中提取獲得。盡管曾經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道，通過使用高糖濃度培養(yǎng)基以及使用玉米漿代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母提取物的方法可以在一定程度上提高運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)GFOR的產(chǎn)量或者降低生物催化劑制備過程的成本(BrazilianJ.Microbiol.2003，34，329-333)，然而整個(gè)過程中GFOR得率以及比酶活低仍未能得到有效的解決。

【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種通過構(gòu)建一個(gè)葡萄糖-果糖氧化還原酶(GFOR)過表達(dá)質(zhì)粒，并在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis?ZM4)中將GFOR過量表達(dá)，及其在制備山梨醇中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明使用的表達(dá)載體是本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的革蘭氏陰性菌細(xì)菌廣泛宿主接合轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pLT20a；所構(gòu)建的表達(dá)載體pLT20a-gfo的表達(dá)單元具有如表1所示的核苷酸序列(SEQ?ID?No：1)，其中引物序列根據(jù)此序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，并通過在引物的兩端添加XbaI和EcoRI限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列用于基因的克隆以及pLT20a-gfo載體的構(gòu)建；

本發(fā)明所設(shè)計(jì)的構(gòu)建引物，具有如表2所示的核苷酸序列(SEQ?ID?No：2)；

本發(fā)明所構(gòu)建的多拷貝表達(dá)載體pLT20a-gfo，其在Z.mobilis?ZM4菌體中的拷貝數(shù)為兩個(gè)或者兩個(gè)以上；