[發明專利]基于原子力顯微鏡的DNA液態檢測方法

無效

• 申請號: 200910055594.5
• 申請日: 2009-07-30
• 公開（公告）號: CN101614647A
• 公開（公告）日: 2009-12-30
• 發明（設計）人: 沈新程;劉曉晟;許建榮;何丹農
• 申請（專利權）人: 上海納米技術及應用國家工程研究中心有限公司
• 主分類號: G01N13/16
• 分類號: G01N13/16;G01N1/38
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術領域

本發明涉及的是一種生物檢測技術領域的檢測方法，具體是一種基于原子力顯微鏡的DNA液態檢測方法。

背景技術

1985年Binnig與斯坦福大學的C.F.Quate和IBM蘇黎士實驗室的Christoph?Gerber合作推出了原子力顯微鏡(Atomic?Force?Microscopy，簡稱AFM)，原子力顯微鏡是通過控制并檢測樣品-針尖之間的相互作用力來實現高分辨成像的，它能獲得納米尺度上的物質形貌，同時能檢測分子間相互作用力，且對樣品的導電性沒有要求，因此其在生命科學領域被廣泛地應用。AFM出現后，在生物領域得到了廣泛地應用，受到了生物學家的關注和青睞。其可以在單分子水平上觀察生物大分子的結構特征，同時可以揭示單個生物分子之間相互作用的信息，可以直觀地觀察和了解生命動態過程。這些都是生物學家一直夢寐以求的目標。因此，各種生物大分子，如DNA、蛋白質、RNA、酶、染色體等的原子力顯微鏡成像技術得以發展和應用。

但是，對于生物樣品，如DNA、RNA分子等，如何將其在基底表面比較牢固的固定，同時又能保持其原始的狀態，最終實現單分子成像，一直是許多研究者關注的重點。對于原子力顯微鏡樣品的制備，基底的表面狀態和性質如基底的表面能、表面電荷、以及表面親水性質等對于最終樣品的固定都起著十分重要的作用。而對于DNA樣品，其本身荷負電，而通常用于原子力顯微鏡成像的基底云母也是荷負電的，因此如何實現DNA樣品在云母基底上的固定是實現DNA的AFM成像的基本。

現在報道較多的方法有如下三種：直接吸附法、靜電作用固定法和共價健合法。但這些方法大部分都局限在大氣下的DNA分子成像，而很多DNA相關的生命過程只有在溶液中觀察才能反映生物體內的真實情況，因此發展簡單可行、可靠的用于溶液中DNA分子的AFM成像方法是更好地利用原子力顯微鏡觀察DNA有關的生命過程和了解DNA有關的生物反應的基礎。綜上所述，現階段繼續一種溶液中DNA分子的AFM成像方法。

發明內容

本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種基于原子力顯微鏡的DNA液態檢測方法，適合于AFM在溶液中的成像觀察，且重現性好、清晰度好、穩定性好，可進行多次AFM掃描成像；同時可避免一些緩沖溶液中二價陽離子參與的有關DNA的生物反應的觀察。

本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括以下步驟：

第一步、配置緩沖溶液，然后將待觀察DNA溶液進行稀釋，制成DNA樣品溶液；

所述的緩沖溶液是指：濃度為5.0~10.0mmol/L的MgCl₂溶液；

所述的稀釋是指：將待觀察DNA樣品稀釋至濃度為2.5~5.0ng/μL的DNA樣品溶液；

第二步、取DNA樣品溶液滴于云母基底上，待吸附后用超純水沖洗，最后直接在云母基底上設置成像檢測池；

所述的云母基底是指新鮮剝離的云母片；

所述的超純水的電阻大于18.2兆歐；

所述的成像檢測池是指直徑為12mm的聚四氟乙烯環；

第三步、在成像檢測池中加入成像緩沖液后，在成像緩沖液中對固定在云母基底上的DNA樣品溶液中的DNA進行原子力顯微鏡成像檢測。

所述的成像緩沖液為40.0mmol/L濃度的4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶液。

所述的原子力顯微鏡使用美國MI公司的PicoScan型AFM儀器，采用小型掃描頭，掃描范圍為6.5×6.5μm²，成像模式為MAC模式，該原子力顯微鏡的針尖使用MI公司的MAClever?type?II型針尖，共振頻率為78kHz，力常數為0.35N/m。掃描速度控制在1.8-2.4?lines/s的范圍內進行。

所述的成像檢測是指對DNA中的待檢測區域進行20-30次的原子力掃描，獲得對應位置的DNA長度、寬度以及構象。

本發明固定DNA樣品，制備方法簡單，操作易控。DNA分子的成像重現性、穩定性好。每次樣品按此操作方法固定都能在溶液下得到較高質量的溶液下的DNA分子的AFM圖像。同時，同一樣品區域經過反復20-30次左右的掃描，都不會造成DNA分子的漂移和損傷。而且，通過此方法可以實現在沒有二價離子存在的緩沖溶液中的DNA分子的AFM成像，因此可以避免一些需要在緩沖溶液中避免二價陽離子參與的DNA有關的生物反應過程的觀察，為檢測生命過程中DNA分子的構象等提供了有效的手段。

附圖說明

圖1為大氣下DNA分子的AFM成像。