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[發明專利]基于原子力顯微鏡的DNA液態檢測方法無效

專利信息
申請號: 200910055594.5 申請日: 2009-07-30
公開(公告)號: CN101614647A 公開(公告)日: 2009-12-30
發明(設計)人: 沈新程;劉曉晟;許建榮;何丹農 申請(專利權)人: 上海納米技術及應用國家工程研究中心有限公司
主分類號: G01N13/16 分類號: G01N13/16;G01N1/38
代理公司: 上海交達專利事務所 代理人: 王錫麟;王桂忠
地址: 200241*** 國省代碼: 上海;31
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摘要:
搜索關鍵詞: 基于 原子 顯微鏡 dna 液態 檢測 方法
【說明書】:

技術領域

發明涉及的是一種生物檢測技術領域的檢測方法,具體是一種基于原子力顯微鏡的DNA液態檢測方法。

背景技術

1985年Binnig與斯坦福大學的C.F.Quate和IBM蘇黎士實驗室的Christoph?Gerber合作推出了原子力顯微鏡(Atomic?Force?Microscopy,簡稱AFM),原子力顯微鏡是通過控制并檢測樣品-針尖之間的相互作用力來實現高分辨成像的,它能獲得納米尺度上的物質形貌,同時能檢測分子間相互作用力,且對樣品的導電性沒有要求,因此其在生命科學領域被廣泛地應用。AFM出現后,在生物領域得到了廣泛地應用,受到了生物學家的關注和青睞。其可以在單分子水平上觀察生物大分子的結構特征,同時可以揭示單個生物分子之間相互作用的信息,可以直觀地觀察和了解生命動態過程。這些都是生物學家一直夢寐以求的目標。因此,各種生物大分子,如DNA、蛋白質、RNA、酶、染色體等的原子力顯微鏡成像技術得以發展和應用。

但是,對于生物樣品,如DNA、RNA分子等,如何將其在基底表面比較牢固的固定,同時又能保持其原始的狀態,最終實現單分子成像,一直是許多研究者關注的重點。對于原子力顯微鏡樣品的制備,基底的表面狀態和性質如基底的表面能、表面電荷、以及表面親水性質等對于最終樣品的固定都起著十分重要的作用。而對于DNA樣品,其本身荷負電,而通常用于原子力顯微鏡成像的基底云母也是荷負電的,因此如何實現DNA樣品在云母基底上的固定是實現DNA的AFM成像的基本。

現在報道較多的方法有如下三種:直接吸附法、靜電作用固定法和共價健合法。但這些方法大部分都局限在大氣下的DNA分子成像,而很多DNA相關的生命過程只有在溶液中觀察才能反映生物體內的真實情況,因此發展簡單可行、可靠的用于溶液中DNA分子的AFM成像方法是更好地利用原子力顯微鏡觀察DNA有關的生命過程和了解DNA有關的生物反應的基礎。綜上所述,現階段繼續一種溶液中DNA分子的AFM成像方法。

發明內容

本發明針對現有技術存在的上述不足,提供一種基于原子力顯微鏡的DNA液態檢測方法,適合于AFM在溶液中的成像觀察,且重現性好、清晰度好、穩定性好,可進行多次AFM掃描成像;同時可避免一些緩沖溶液中二價陽離子參與的有關DNA的生物反應的觀察。

本發明是通過以下技術方案實現的,本發明包括以下步驟:

第一步、配置緩沖溶液,然后將待觀察DNA溶液進行稀釋,制成DNA樣品溶液;

所述的緩沖溶液是指:濃度為5.0~10.0mmol/L的MgCl2溶液;

所述的稀釋是指:將待觀察DNA樣品稀釋至濃度為2.5~5.0ng/μL的DNA樣品溶液;

第二步、取DNA樣品溶液滴于云母基底上,待吸附后用超純水沖洗,最后直接在云母基底上設置成像檢測池;

所述的云母基底是指新鮮剝離的云母片;

所述的超純水的電阻大于18.2兆歐;

所述的成像檢測池是指直徑為12mm的聚四氟乙烯環;

第三步、在成像檢測池中加入成像緩沖液后,在成像緩沖液中對固定在云母基底上的DNA樣品溶液中的DNA進行原子力顯微鏡成像檢測。

所述的成像緩沖液為40.0mmol/L濃度的4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶液。

所述的原子力顯微鏡使用美國MI公司的PicoScan型AFM儀器,采用小型掃描頭,掃描范圍為6.5×6.5μm2,成像模式為MAC模式,該原子力顯微鏡的針尖使用MI公司的MAClever?type?II型針尖,共振頻率為78kHz,力常數為0.35N/m。掃描速度控制在1.8-2.4?lines/s的范圍內進行。

所述的成像檢測是指對DNA中的待檢測區域進行20-30次的原子力掃描,獲得對應位置的DNA長度、寬度以及構象。

本發明固定DNA樣品,制備方法簡單,操作易控。DNA分子的成像重現性、穩定性好。每次樣品按此操作方法固定都能在溶液下得到較高質量的溶液下的DNA分子的AFM圖像。同時,同一樣品區域經過反復20-30次左右的掃描,都不會造成DNA分子的漂移和損傷。而且,通過此方法可以實現在沒有二價離子存在的緩沖溶液中的DNA分子的AFM成像,因此可以避免一些需要在緩沖溶液中避免二價陽離子參與的DNA有關的生物反應過程的觀察,為檢測生命過程中DNA分子的構象等提供了有效的手段。

附圖說明

圖1為大氣下DNA分子的AFM成像。

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