[發明專利]一種人臍帶間充質干細胞庫的構建方法

有效

• 申請號: 200910055219.0
• 申請日: 2009-07-23
• 公開（公告）號: CN101608174A
• 公開（公告）日: 2009-12-23
• 發明（設計）人: 高峰;錢燕翔
• 申請（專利權）人: 章毅;上海市干細胞技術有限公司
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08;A01N1/02
• 代理公司: 上海東創專利代理事務所
• 代理人: 馬 云;曹立維

1.一種人臍帶間充質干細胞庫的構建方法，由下述步驟組成：

(1)取人臍帶進行ABO/Rh血型檢測、HLA分型檢測、微生物免疫檢測、 用緩沖液沖洗去除殘留血液，剪碎，獲得人臍帶組織；

(2)向步驟(1)所獲得人臍帶組織中加入1-3倍體積的0.05％-0.2％膠

原酶消化，所述膠原酶消化溫度為37℃，消化時間為2h，并獲得消化后組

織；

(3)加入緩沖液稀釋步驟(2)消化后組織，混勻、離心，離心力為600g， 時間為15分鐘；

(4)棄上清，加入緩沖液重懸步驟(3)沉淀，過200目篩網，收集濾液， 離心，離心力為450g，時間為10分鐘，重復兩次，即獲得人臍帶間充質干 細胞；

(5)將步驟(4)得到的人臍帶間充質干細胞按2×10⁴/cm²接種于塑料 培養皿，用含10％FBS的LG-DMEM培養基，置37℃、5％CO₂培養箱培養， 2天后換液，棄去非貼壁細胞，以后每3天后換液，待細胞80％匯合，0.25％ 胰酶消化，按1∶3傳代，擴增后得到大量間充質干細胞，并用冷凍保護劑預 處理，分裝放入凍存管，所述冷凍保護劑由10％DMSO、10％右旋糖苷和 80％LG-DMEM組成。

(6)將步驟(5)獲得的人臍帶間充質干細胞置液氮保存，按其ABO/Rh 分型和HLA分型進行保存，建立可供檢索的細胞信息檔案，即構建出人臍 帶間充質干細胞庫。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述緩沖液為磷酸緩 沖液。

3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，所述磷酸緩沖液pH 值為7.2-7.4。

4.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述膠原酶消化的同 時，通過用轉子進行攪拌來提高消化程度。