[發明專利]一種干擾Survivin表達的siRNA分子及其應用

有效

• 申請號: 200910054393.3
• 申請日: 2009-07-03
• 公開（公告）號: CN101935650A
• 公開（公告）日: 2011-01-05
• 發明（設計）人: 孫云成;陳莉;李鐵軍;陸毅祥;朱遠源
• 申請（專利權）人: 百奧邁科生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;A61K48/00;A61P35/00;A61P35/02
• 代理公司: 上海市華誠律師事務所 31210
• 代理人: 徐申民;涂勇

技術領域

本發明涉及一種可干擾Survivin表達的siRNA分子、及其在制備抗腫瘤藥物中的應用。

背景技術

Survivin(存活素)是凋亡抑制蛋白(Inhibitorofapoptosis，IAP)家族的新成員，是目前發現最強的凋亡抑制因子。Survivin功能復雜，具有抑制細胞凋亡，促進細胞轉化并且參與細胞的有絲分裂、血管的生成和腫瘤細胞耐藥性的產生等作用。Survivin基因是Ambrosini等(Nature?Med，1997，3(8)：917-921)在人類基因組文庫中篩選克隆到的，該基因全長15KB，定位于17q25，含4個外顯子和3個內含子，Survivin基因編碼產物是由142個氨基酸組成的蛋白，分子量16.2KD。研究顯示，Survivin的高表達能抑制多種因子如p53、caspases等誘導的細胞凋亡。經轉基因技術證實Survivin抑制凋亡的機制與IAP家族其它成員一樣，可直接作用于細胞色素C從線粒體向胞質釋放的過程的末期。現已發現，Survivin基因在胚胎組織及惡性腫瘤中普遍表達，如乳腺癌、胃癌、腎癌、黑色素癌、腸癌、神經母細胞癌和卵巢癌等；但在分化成熟的組織(除胎盤、增殖期子宮內膜、分泌期子宮內膜有微量表達外)及癌旁正常組織中無表達。它的這一特性，使得靶向Survivin的免疫治療和基因治療能夠促進腫瘤細胞的凋亡，抑制其增殖，正常組織卻能不受損傷和影響。

RNA干擾技術是近幾年來興起的生物技術，該項技術的發現為疾病治療尤其是癌癥的治療開辟了全新的途徑，為科研工作者提供了一個全新的基因治療理念。用siRNA干擾特定基因的表達是基因治療的重要組成部分。RNA干擾(RNA?interference，RNAi)是由雙鏈RNA(double-stranded?RNA，dsRNA)引發的轉錄后基因沉默機制。其原理是：RNase?III核酶家族的Dicer，與雙鏈RNA結合，將其剪切成21-23nt及3′端突出的小干擾RNA(smallinterfering?RNA，siRNA)，隨后siRNA與RNA誘導沉默復合物(RNA-induced?silencingcomplex，RISC)結合，解旋成單鏈，活化的RISC受已成單鏈的siRNA引導，序列特異性地結合在靶mRNA上并將其切斷，引發靶mRNA的特異性分解，從而阻斷相應基因表達的轉錄后基因沉默機制。RNAi已作為一種簡單有效的基因敲除的技術，廣泛地應用于功能基因組學研究以及抗病毒、抗腫瘤治療的研究中。

目前針對Survivin的RNA干擾研究進展迅速，體外實驗顯示了良好的效果。有很多文獻報道，用RNA干擾的技術來抑制Survivin基因的表達，Carvalho等用小分子干擾RNA(small?interfering?RNA，siRNA)轉染HeLa細胞，60h后蛋白印跡結果顯示治療組中已檢測不到Survivin的表達，細胞增殖明顯受抑，部分細胞有絲分裂受到阻滯，出現凋亡(J?Cell?Sci，2003，116(14)：2987-2998)。應用RNA干擾技術，用靶向至Survivin基因的siRNA作為靶向藥物，在基因的轉錄后進行干擾，從而誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的有絲分裂，抑制腫瘤轉移時的血管形成和降低腫瘤細胞放化療的耐受性，對腫瘤進行抑制，在不久的將來可能成為一種新的腫瘤治療方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種通過siRNA分子庫技術篩選出的可干擾Survivin表達的雙鏈siRNA分子，其下述正義鏈和反義鏈組成：

正義鏈：5’-UCCUUUCUGUCAAGAAGCAGUUNn-3’(SEQ?ID?NO：2)

反義鏈：5’-AACUGCUUCUUGACAGAAAGGANn-3，(SEQ?ID?NO：3)

其中，N是4種DNA堿基及其脫氧形式中的任何一種，即胞嘧啶C、鳥嘌呤G、腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、脫氧胞嘧啶dC、脫氧鳥嘌呤dG、脫氧腺嘌呤dA或脫氧胸腺嘧啶dT；n是0～2的整數。

換句話說，該雙鏈siRNA分子的主干序列為

正義鏈：5’-UCCUUUCUGUCAAGAAGCAGUU-3’(SEQ?ID?NO：4)

反義鏈：5’-AACUGCUUCUUGACAGAAAGGA-3’(SEQ?ID?NO：5)

在一個優選的實施方式中，上述序列中3’端的“Nn”是兩個脫氧胸腺嘧啶dTdT。

本發明的另一目的在于提供上述siRNA分子在制備抗腫瘤藥物中的應用。