[發(fā)明專利]一種具有β-內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910054340.1
• 申請(qǐng)日: 2009-07-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101935341A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-01-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡又佳;謝麗萍;許明飛;朱寶泉;朱春寶
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院
• 主分類號(hào): C07K14/36
• 分類號(hào): C07K14/36;C12N15/31;C12N15/63;C12N1/21;C12P21/02;A61K38/16;A61P31/04;C12R1/19
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 薛琦;朱水平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種具有β-內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽及其制備方法和應(yīng)用，包括該多肽的編碼基因及其重組表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化子。

背景技術(shù)

β-內(nèi)酰胺類抗生素(青霉素和頭孢菌素)在臨床上用于治療多種細(xì)菌感染疾病，但隨著抗生素的廣泛應(yīng)用以及某種程度上的濫用，耐藥菌在不斷地產(chǎn)生，它們對(duì)許多β-內(nèi)酰胺抗生素耐藥，從而使這類藥物對(duì)耐藥菌感染的疾病無(wú)效。微生物來(lái)源的β-內(nèi)酰胺酶的抑制劑棒酸(Clavulanic?acid)及其β-內(nèi)酰胺砜類化合物舒巴坦(Sulbactam)和他佐巴坦(Tazobactam)，均在七十年代至八十年代被發(fā)現(xiàn)并證實(shí)是有效的β-內(nèi)酰胺酶的抑制劑，且作為“自殺者”與β-內(nèi)酰胺抗生素合并用藥，可達(dá)到抑制β-內(nèi)酰胺酶活力、增強(qiáng)β-內(nèi)酰胺抗生素療效的目的。然而，這些小分子化合物對(duì)一些細(xì)菌產(chǎn)生的由染色體介導(dǎo)的I型β-內(nèi)酰胺酶的抑制作用都很小。

近來(lái)人們從帶棒鏈霉菌(Streptomyces?clavuligerus)中分離到β-內(nèi)酰胺酶抑制蛋白(β-lactamase?inhibitory?protein，BLIP)，可以特異性的抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性，隨后又有BLIP-I、BLIP-II被發(fā)現(xiàn)。但是β-內(nèi)酰胺酶抑制蛋白BLIP，分子量比較大，有165個(gè)氨基酸組成，并不適合開(kāi)發(fā)成為臨床使用的藥物。BLIP與β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)合具有幾個(gè)關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)。本申請(qǐng)人的專利ZL200410084577.1中根據(jù)關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)并合成了隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)，從中篩選到24肽SIPIS04-01，體外作用表明具有抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性，適合用于作為基因工程表達(dá)藥物，但是該24肽SIPIS04-01的抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性并不高。

發(fā)明內(nèi)容

因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題就是針對(duì)現(xiàn)有的具有β-內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽存在的活性低的不足，提供一種新的具有β-內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽及其制備方法和應(yīng)用，同時(shí)提供該多肽的編碼序列及其重組表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化子。

本發(fā)明人經(jīng)過(guò)仔細(xì)研究發(fā)現(xiàn)，隨著B(niǎo)LIP與β-內(nèi)酰胺酶結(jié)合關(guān)系的研究的深入，包括結(jié)構(gòu)生物學(xué)以及熱力學(xué)，影響二者結(jié)合的“熱點(diǎn)”(hotspot)關(guān)鍵氨基酸不斷被發(fā)現(xiàn)。據(jù)此，本發(fā)明人通過(guò)反復(fù)的試驗(yàn)，將之前得到的24肽SIPIS04-01的編碼基因，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性進(jìn)行改造，然后通過(guò)關(guān)鍵位點(diǎn)的氨基酸替換，并延長(zhǎng)其N端，終于制備了新的具有更強(qiáng)β-內(nèi)酰胺酶抑制活性的小肽，從而完成了本發(fā)明。

因此，本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之一是：一種具有β-內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?NO.6所示，其中，第25位的“Xaa”表示非極性氨基酸殘基。

本發(fā)明中，所述的非極性氨基酸殘基包括Ile，Met，Gly，Ala，Val，Pro，Leu，Trp，或Phe，較佳的是丙氨酸(Gly)殘基或甘氨酸(Ala)殘基。當(dāng)所述的非極性氨基酸殘基是丙氨酸殘基或甘氨酸殘基時(shí)，本發(fā)明所述的多肽的氨基酸序列較佳的如序列表中SEQ?ID?NO.2或SEQ?ID?NO.4所示。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之二是：一種DNA序列，其編碼具有β-內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽，是下列之一：

1)其核苷酸序列是序列表中SEQ?ID?NO.5所示，其中，第73～75位的“nbn”表示編碼非極性氨基酸殘基的密碼子序列；

2)其編碼如序列表中SEQ?ID?NO.6所示的氨基酸序列的多肽，其中，第25位的“Xaa”表示非極性氨基酸殘基。

本發(fā)明中，所述的非極性氨基酸殘基包括Ile，Met，Gly，Ala，Val，Pro，Leu，Trp，或Phe，較佳的是丙氨酸(Gly)殘基或甘氨酸(Ala)殘基。當(dāng)所述的非極性氨基酸殘基是丙氨酸殘基或甘氨酸殘基時(shí)，本發(fā)明的編碼具有β-內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽的DNA序列，較佳的是下列之一：1)其核苷酸序列是序列表中SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.3所示；2)其編碼如序列表中SEQ?ID?NO.2或SEQ?ID?NO.4所示的氨基酸序列的多肽。

本發(fā)明還提供一種重組載體，其含有任一項(xiàng)如上所述的DNA分子。較佳的，所述的重組載體的載體骨架是質(zhì)粒pET32a。

本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)化體，其含有如上所述的重組載體。較佳的，所述的轉(zhuǎn)化體的宿主細(xì)胞是大腸桿菌(Escherichia?coli，E.coli)，如E.coli?BL21(DE3)。