[發明專利]一種Exendin-4衍生物的重組制備方法和應用

無效

• 申請號: 200910054102.0
• 申請日: 2009-06-29
• 公開（公告）號: CN101665799A
• 公開（公告）日: 2010-03-10
• 發明（設計）人: 汪洋;馮震;顧娟;吳自榮;黃靜;勞勛
• 申請（專利權）人: 華東師范大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P21/02;A61K38/17;A61P3/10;C12R1/19
• 代理公司: 上海金盛協力知識產權代理有限公司
• 代理人: 董紅曼

1.一種Exendin-4衍生物的重組制備方法，其特征在于，包括步驟：

(1)按Exendin-4衍生物的氨基酸序列合成基因片段；

(2)構建含有Exendin-4衍生物編碼序列的重組表達載體；

(3)用含有Exendin-4衍生物或融合的Exendin-4衍生物基因序列的表達載體轉入原核生物的宿主細胞，獲得基因工程菌株；

(4)將基因工程菌株經液體發酵，離心獲得含有Exendin-4衍生物融合蛋白或單獨含有Exendin-4衍生物蛋白的濕菌體；

(5)將濕菌體破壁，分離獲得含Exendin-4衍生物融合蛋白或單獨含有Exendin-4衍生物蛋白的粗品；

(6)經純化，冷凍干燥制得Exendin-4衍生物。

2.根據權利要求1所述Exendin-4衍生物的制備方法，其特征在于，該衍生物的分子結構式為Seq?ID?No.2，即Exendin-4(1-39)-Xaa40，其中Xaa40＝Cys；

步驟(1)中，按Exendin-4衍生物的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛密碼子，合成以下長度為164bp的片斷，即Seq?ID?No.9：

gccctagatc?tggatgacga?tgacaagcat?ggcgaaggca?cctttaccag?cgatctgagc?60

aaacagatgg?aagaagaagc?ggtgcgcctg?tttattgaat?ggctgaaaaa?tggtggtccg?120

agcagcggtg?cgccgccgcc?gagcnnntaa?tgaaagctta?aact??164

其中，n145＝t，n146＝g，n147＝c；

其中，該片斷含有腸激酶EK位點、Exendin-4衍生物基因、終止密碼子TAA以及限制性內切酶BglII和HindIII位點；

步驟(2)中，以限制性內切酶BglII和HindIII雙酶切，以大腸桿菌質粒pET32a(+)為表達載體，構建得到含有Exendin-4衍生物基因序列的重組質粒pET32a(+)-m39Exendin-4；

步驟(3)中，宿主受體菌為大腸桿菌BL21(DE3)。

3.根據權利要求2所述Exendin-4衍生物的制備方法，其特征在于，以敲除硫氧還蛋白方式制備Seq?ID?No.2的Exendin-4衍生物；其中步驟(2)中，將含有Exendin-4衍生物基因序列的質粒pET32a(+)-m39Exendin-4用限制性內切酶Nde?I酶切，構建得到含有Exendin-4衍生物基因序列的質粒pET32a(+)-m39Exendin-4(Trx-)，其中Trx是硫氧還蛋白。

4.根據權利要求1所述Exendin-4衍生物的制備方法，其特征在于，該衍生物的分子結構式為Seq?ID?No.6，即Exendin-4(1-30)-Xaa31，其中Xaa31＝Cys；

步驟(1)中，按Exendin-4衍生物的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛密碼子，合成以下長度為137bp的片斷，即Seq?ID?No.12：

cctccagatc?tggatgacga?tgacaagcat?ggcgaaggca?cctttaccag?cgatctgagc?60

aaacagatgg?aagaagaagc?ggtgcgcctg?tttattgaat?ggctgaaaaa?tggcggcnnn?120

taatgaaagc?ttcctcc??137

其中，n118＝t，n119＝g，n120＝c；

其中，該片斷含有腸激酶EK位點、Exendin-4衍生物基因、終止密碼子TAA以及限制性內切酶BglII和HindIII位點；

步驟(2)中，用限制性內切酶BglII和HindIII雙酶切，以大腸桿菌質粒pET32a(+)為表達載體，構建得到含有Exendin-4衍生物基因序列的重組質粒pET32a(+)-m30Exendin-4；

步驟(3)中，受體菌是大腸桿菌BL21(DE3)。