[發(fā)明專利]適于動物細胞產(chǎn)品生產(chǎn)的無動物來源低蛋白培養(yǎng)基

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910053506.8
• 申請日: 2009-06-19
• 公開（公告）號: CN101603026A
• 公開（公告）日: 2009-12-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 譚文松;趙亮;周燕;陳飛
• 申請（專利權(quán)）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06;C12P21/02;C12P21/08
• 代理公司: 上海翼勝專利商標事務(wù)所（普通合伙）
• 代理人: 刁文魁;翟 羽

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及現(xiàn)代生物技術(shù)之培養(yǎng)基研發(fā)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種適于動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)及抗體、融合蛋白等重組蛋白藥物產(chǎn)品生產(chǎn)的無動物來源低蛋白培養(yǎng)基。

【技術(shù)背景】

動物細胞培養(yǎng)技術(shù)是當今生物工程領(lǐng)域中的前沿課題之一，無論是基礎(chǔ)研究還是生產(chǎn)實踐方面都得到生物技術(shù)界的重視。2000年以來，F(xiàn)DA批準的所有創(chuàng)新生物技術(shù)藥物中，用酵母表達的只有2種，用大腸桿菌表達的只有6種，而用哺乳動物細胞表達或生產(chǎn)的藥物達到55種，占70％以上。2003年6月～2004年6月全球銷售額最高的10個生物技術(shù)藥物中，哺乳動物細胞表達的產(chǎn)品占8個，并且年銷售額超過20億美元的前6位的生物技術(shù)藥物全部是哺乳動物細胞表達的產(chǎn)品。2005年全球生物技術(shù)藥物銷售額超過500億美元，哺乳動物細胞表達產(chǎn)品占70％。至2007年末，僅單克隆抗體藥物的銷售額就達到260億美元，預(yù)計至2013年其銷售額將達到490億美元。應(yīng)用無血清培養(yǎng)技術(shù)進行動物細胞的規(guī)?；囵B(yǎng)及重組蛋白表達生產(chǎn)已成為一種趨勢。

隨著哺乳動物細胞培養(yǎng)規(guī)模的擴大和生物藥物需求的增長，基于細胞及產(chǎn)品特性的無血清培養(yǎng)基的研制已成為細胞工程領(lǐng)域的重要課題。在疫苗生產(chǎn)、單克隆抗體和各種生物活性蛋白等生物制品的應(yīng)用領(lǐng)域中，優(yōu)化無血清培養(yǎng)基的成分，使工程細胞在最有利于其生長和目的產(chǎn)物表達的培養(yǎng)環(huán)境中維持較高的活細胞密度和較長的培養(yǎng)時間，是降低生產(chǎn)成本的有效方法。

與傳統(tǒng)的有血清培養(yǎng)基相比，無血清培養(yǎng)基具有諸多優(yōu)勢：第一，無批次差異、無不明血清組分對細胞的影響；第二，避免了血清中外源性污染及對細胞的毒害作用；第三，使產(chǎn)品易于純化，提高回收率；第四，成分明確，有利于研究細胞的生理狀態(tài)，可根據(jù)不同細胞株設(shè)計和優(yōu)化能支持其高密度培養(yǎng)和產(chǎn)物高水平表達的培養(yǎng)基。此外，無血清培養(yǎng)技術(shù)也是進行細胞生長、增殖、分化及基因表達調(diào)控等基礎(chǔ)研究的關(guān)鍵技術(shù)之一。

無血清培養(yǎng)基的開發(fā)與優(yōu)化，主要有以下兩個發(fā)展方向：一是不添加任何動物來源的成分；二是降低培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)含量。據(jù)此，無血清培養(yǎng)基可以分為以下三種：

(一)傳統(tǒng)的無血清培養(yǎng)基，即用各類可替代血清功能的組分配制而成，如添加牛血清白蛋白(BSA)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、從血清中提取的混合脂類及水解蛋白等組分，其特點是蛋白含量高，含有大量動物來源蛋白。

(二)無動物來源成分的培養(yǎng)基，即祛除培養(yǎng)基中的動物來源成分。由于動物來源成分中可能含有潛在的朊蛋白和病毒污染的危險，因此，在培養(yǎng)基中必須慎用動物來源成分，這樣才可確保生產(chǎn)的重組蛋白安全可靠。

(三)低蛋白或無蛋白培養(yǎng)基，即減少或祛除培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)成分。降低培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)含量，可減少產(chǎn)物的分離純化步驟，提高目標蛋白的回收率和品質(zhì)，保證批次間的一致性，從而實現(xiàn)整個生產(chǎn)過程的高效率和經(jīng)濟性。

綜上所述，動物細胞無血清培養(yǎng)基的開發(fā)與優(yōu)化是朝著“無動物來源、無蛋白”的方向發(fā)展的。

經(jīng)過幾十年的發(fā)展，哺乳動物細胞〔如雜交瘤、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、NSO等〕無血清培養(yǎng)基技術(shù)已取得了可喜的進展：

Darfler等人開發(fā)了CITTL無血清培養(yǎng)基，以DMEM/F12(1∶1)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加了5mg/L的過氧化氫酶、1.5mg/L的胰島素、1.5～3.0mg/L的轉(zhuǎn)鐵蛋白、2nmol/L睪酮、0.5mg/L的二亞油酰磷脂膽堿和1.5mg/L的β-甘油磷酸，可支持sf9細胞的克隆化生長，也可用于雜交瘤細胞的培養(yǎng)。

Murakami等人開發(fā)了無血清培養(yǎng)基，以DMEM/F12(1∶1)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加了5mg/L胰島素、2～35mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、20μmol/L乙醇胺和1nmol/L亞硒酸鈉等物質(zhì)，這就是現(xiàn)被廣泛使用的DMEM/F12-ITES配方。

Kover和Frank開發(fā)了無血清培養(yǎng)基，以RPMI1640為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加10mg/L胰島素、5mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、20μmol/L乙醇胺、5mg/L亞油酸、1g/L牛血清蛋白、3mg/L抗壞血酸、2μg氫化可的松和12種微量元素，可支持幾種細胞的生長。

美國專利U.S.P.4927762公開了一種含有抗氧化劑的培養(yǎng)基，闡述了細胞在還原性介質(zhì)中能更好地生長，同時指出，N-乙酰半胱氨酸、硫乳酸、巰基乙醇等物質(zhì)的添加可以起到抗氧化的作用。