[發(fā)明專利]一種蛋白質(zhì)及其編碼基因以及自殺載體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910052848.8
• 申請日: 2009-06-10
• 公開（公告）號: CN101921327A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 肖愛軍;邵永勝;嚴引娣
• 申請（專利權(quán)）人: 上海捷瑞生物工程有限公司
• 主分類號: C07K14/46
• 分類號: C07K14/46;C12N15/12;C12N15/63;C12N1/21;C12N15/64;C12R1/19
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 胡美強

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種蛋白質(zhì)及其編碼基因以及自殺載體。

背景技術(shù)

為了快速篩選到含有目的基因片段的陽性克隆，廣大科研工作者發(fā)明了多種檢測工具，如應(yīng)用β-半乳糖苷酶基因的藍-白斑篩選，抗生素篩選，聚合酶鏈反應(yīng)篩選，通過工具酶篩選等等。但都存在一些缺陷。藍-白斑篩選陽性克隆率較低，一般是＜80％。在β-半乳糖苷酶基因失效或載體自連時會存在假陽性，白色克隆也不一定含有目的片段，并且假陽性率較高，＞15％；抗生素篩選只是其他篩選的一種輔助，不能獨立使用。聚合酶鏈反應(yīng)篩選所需時間較長，并且很容易造成交叉污染。工具酶篩選時間較長，工業(yè)用戶成本較高。如何克服上述幾種篩選方法的缺點，綜合利用相對應(yīng)的優(yōu)點，制備出一種自殺載體，是科研人員要解決的首要問題。

NCBI數(shù)據(jù)庫中的神經(jīng)毒性基因ABX58152是從蛇(Austrelaps?labialis)中分離到的一個基因，其編碼107個氨基酸殘基的神經(jīng)毒性蛋白。該毒性蛋白專門作用于神經(jīng)細胞，特別是膜蛋白的交互作用而導(dǎo)致毒性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對現(xiàn)有的基因克隆技術(shù)中的陽性克隆的藍-白斑篩選法存在篩選步驟多，假陽性率高的缺陷，提供一種新的載體，該載體用于克隆技術(shù)中篩選步驟少，假陽性率低。本發(fā)明同時提供一種細胞毒性蛋白質(zhì)及其編碼基因。

本發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)的試驗研究，驚喜的發(fā)現(xiàn)，通過對基因ABX58152編碼的神經(jīng)毒性蛋白的優(yōu)化改造，改造后的蛋白對常規(guī)細胞也具有非常強的毒性，在克隆過程中無法得到目的蛋白，而打破其正常構(gòu)造，引入外源片段，很容易就得到所需基因序列。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人將該基因序列進行優(yōu)化，作為宿主細胞的自殺基因，經(jīng)過反復(fù)試驗，終于成功的制備一種自殺載體，極大簡化常規(guī)分子生物學(xué)操作中的篩選過程，從而完成了本發(fā)明。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是：一種蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?NO：2所示。所述的蛋白質(zhì)具有細胞毒性。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是：一種基因，其堿基序列是以下序列之一：

(1)如序列表中SEQ?ID?NO：1中第4～267位所示的核苷酸序列；

(2)編碼如序列表中SEQ?ID?NO：2所示的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之三是：一種載體，其含有如上所述的基因。

其中，所述的載體的原始載體是現(xiàn)有的常規(guī)載體，較佳的是利用α-互補原理的載體，更佳的是質(zhì)粒pTZ19R。所述的基因位于載體中的β-半乳糖苷酶基因與F1信號基因(f1?packaging?signal基因)之間，并且所述的基因和β-半乳糖苷酶基因具有相同的閱讀框架。所述的載體中的多克隆位點區(qū)域的限制性酶切位點較佳的是HindIII(712)，SmaI(720)，EcoRV(725)和HindIII(734)。比如原始的pTZ19R質(zhì)粒中的多克隆位點區(qū)域的限制性酶切位點包括EcoRI(615)，SacI(621)，KpnI(627)，SmaI(631)，BamHI(636)，XbaI(642)，SalI(648)，PstI(654)，SphI(660)和HindIII(666)。移除掉較多的限制性內(nèi)切酶識別序列，可以保證最后克隆產(chǎn)物預(yù)留酶切位點的單一性，有效避免在轉(zhuǎn)換載體時引入其他外源序列。利用α-互補原理的載體中的多克隆位點包含在在編碼β-半乳糖苷酶篩選基因序列(LacZ)之中。本發(fā)明的載體也利用了α-互補原理。

本發(fā)明所述載體的制備方法包括以下步驟：在原始載體中的β-半乳糖苷酶基因的3’末端終止位點(如TAA)之前插入所述的細胞毒性基因，并使β-半乳糖苷酶基因、細胞毒性基因的閱讀框架一致。更佳的，移除掉載體的多克隆位點區(qū)域中的多個限制性酶切位點，分別移除了SacI(621)，KpnI(627)，BamHI(636)，XbaI(642)，SalI(648)，PstI(654)，SphI(660)，HindIII(666)，保留了HindIII和SmaI，增加了EcoRV和另一個HindIII。

本發(fā)明還提供一種以所述的載體為基礎(chǔ)骨架的重組載體。該重組載體以本發(fā)明的載體為基礎(chǔ)骨架插入了外源DNA片段。

本發(fā)明還提供含有所述重組載體的轉(zhuǎn)化子。