[發明專利]熒光定量PCR定性檢測高危型HPV的方法及其試劑盒

無效

• 申請號: 200910051131.1
• 申請日: 2009-05-13
• 公開（公告）號: CN101886137A
• 公開（公告）日: 2010-11-17
• 發明（設計）人: 張艷;李寧麗;顧關林;馬式薇;陳勇;姜惠民;何昕;蔡佩民;管愛民
• 申請（專利權）人: 上海多納美企業發展有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64;C12R1/93
• 代理公司: 上海衡方知識產權代理有限公司 31234
• 代理人: 卞孜真;金重慶

1.一種熒光定量PCR定性檢測高危型HPV的方法，該方法依次包括如下步驟：

A)根據待檢測的HPV基因的特異性核酸序列分別合成13對引物，上下游引物之間相距50～200個堿基；

B)并根據各型HPV基因的特異性核酸序列中位于兩個引物之間的序列分別設計、合成Taqman熒光探針；、

C)使用步驟A)中的引物和步驟B)中的熒光探針熒光反應體系，其中鎂離子的濃度為1～10mM，Taq聚合酶0.1～5U，各種引物及探針濃度為10～500nM；

D)從待測臨床標本中提取DNA，取適量加入步驟C)中的反應體系中，經離心混合后將反應管放入實時定量PCR反應儀，進行20～50次循環擴增反應，反應結束后測定反應管中的熒光增值；

E)同時用系列陽性和陰性模板也進行D)的核酸提取反應，測得各自相應的代表熒光增值的循環數(Ct值)，根據Ct值算出目的基因相對含量(算法詳見后述)，并將其相對于陽性模板的初始核酸量做圖，制作標準曲線；

F)用上述步驟中獲得的各樣品Ct值計算得出的目的基因的相對含量即可在標準曲線上查出相應的樣品中的核酸起始拷貝數。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟A)中所述的兩個引物之前相距73～104個堿基。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟D)中所述的PCR反應進行30～50個循環。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于：步驟D)中所述的PCR反應進行35～45個循環。

5.一種用于熒光定量PCR定性檢測高危型HPV方法的試劑盒，它包括：熒光PCR反應液，陽性模板，陰性模板以及根據待測核酸的特異性核酸序列設計的PCR引物和熒光引物，該熒光PCR反應液中鎂離子的濃度為1～10mM，Taq聚合酶0.1～5(0.625)U。

6.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的待測核酸分別為HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV35，HPV39，HPV45，HPV51，HPV52，HPV56，HPV58，HPV59，HPV67，及內參照基因HMBS。

7.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的特異性核酸序列在NCBI中的序列編號分別為：HPV16?NC001526，HPV18?NC001357，HPV31?J04353，HPV33?M12732，HPV35?M74117，HPV39?M62849，HPV45?X74479，HPV51?M62877，HPV52?X74481，HPV56?X74483，HPV58?D90400，HPV59?X77858，HPV67?D21208，HMBS?M95623.1。