[發明專利]人體外周血淋巴細胞培養基及其應用

有效

• 申請號: 200910050790.3
• 申請日: 2009-05-07
• 公開（公告）號: CN101550408A
• 公開（公告）日: 2009-10-07
• 發明（設計）人: 崔貽芬
• 申請（專利權）人: 上海堯浩生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08
• 代理公司: 上海光華專利事務所
• 代理人: 許亦琳;余明偉

技術領域

本發明涉及一種人體外周血淋巴細胞培養基及其應用。

背景技術

人體外周血液中的小淋巴細胞，幾乎都處在GI期(GO期)，一般情況下是不再分裂的， 在培養液中加入植物凝血素PHA時，這種小淋巴細胞受刺激轉化為淋巴母細胞，隨后進入 有絲分裂，這樣經過短期培養，秋水仙素的處理，低滲和固定，就可獲得部分有絲分裂細 胞。這種方法已為臨床醫學、病毒學、藥理學、遺傳毒性學等方面廣泛應用。研究證實， 許多因素與細胞培養產生密切相關，常見的原因有：

(1)無污染環境：培養環境無毒和無菌是保證細胞生存的首要條件。當細胞放置于體 外培養時，與體內相比細胞丟失了對微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝 物質積累等，可導致細胞死亡。因此在進行培養中，保持細胞生存環境無污染、代謝物及 時清除等，是維持細胞生存的基本條件；

(2)恒定的溫度：維持培養細胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。人體細胞培養的 標準溫度為36.5℃±0.5℃，偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。 培養細胞對低溫的耐受力較對高溫強，溫度上升不超過39℃時，細胞代謝與溫度成正比； 人體細胞在39-40℃1小時，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復；在40-41℃1小時，細 胞會普遍受到損傷，僅小半數有可能恢復；41-42℃1小時，細胞受到嚴重損傷，大部分細 胞死亡，個別細胞仍有恢復可能；當溫度在43℃以上1小時，細胞全部死亡；

(3)氣體環境：氣體是人體細胞培養生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧 化碳。氧氣參與三羧酸循環，產生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種 成分。開放培養時一般把細胞置于95％空氣加5％二氧化碳混合氣體環境中；

(4)恒定的PH值：二氧化碳既是細胞代謝產物，也是細胞生長繁殖所需成分，它在 細胞培養中的主要作用在于維持培養基的PH值。大多數細胞的適宜pH為7.2-7.4，偏離這 一范圍對細胞培養將產生有害的影響。但細胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環境中更利 于細胞生長。細胞培養液pH濃度的調節最常用的為加NaHCO₃的方法，因為NaHCO₃可供CO₂， 但二氧化碳易于逸出，故最適用于封閉培養，而羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)因其對細胞 無毒性，也起緩沖作用，有防止pH迅速變動的特性而用于開放細胞培養技術中，其最大優 點是在開放式培養或細胞觀察時能維持較恒定的pH值；

細胞培養基是培養細胞中供給細胞營養和促使細胞生殖增殖的基礎物質，也是培養細 胞生長和繁殖的生存環境。

培養基的種類很多，按其物質狀態分為半固體培養基和液體培養基兩類；按其來源分 為合成培養基和天然培養基。

(1)合成培養基：如：1640等合成培養基是根據細胞所需物質的種類和數量嚴格 配制而成的。內含碳水化合物、氨基酸、脂類、無機鹽、維生素、微量元素和細胞生長因 子等。單獨使用細胞雖有生存但不能很好的生長增殖。

(2)天然培養基：使用最普遍的天然培養基是血清，基本以牛血清最普遍。由于血 清含有多種細胞因子、促貼附因子及其多活性物質。與合成培養基合用，能使細胞增殖生 長。常見使用量為5-20％。

將合成培養基能使細胞生存的特性和天然培養基能使細胞增殖生長的特性相結合，使 兩種培養基的特性都能獲得發揮。但現有的這種天然培養基與合成培養基配合使用的培養 基配方雖然能使部分細胞生存，但不能達到使淋巴細胞較好的生長增值并進行有絲分裂表 達，缺乏各組份間的合理有效配比，而天然培養基屬于動物血清且存在多種干擾培養淋巴 細胞生長的不利因子，因此并不能直接有效模擬人體血液中環境，試劑的穩定性也不好。

發明內容

本發明的目的是提供一種人體外周血淋巴細胞培養基及其應用。本發明提供的細胞培 養基淋巴細胞轉換率與淋巴細胞分裂指數高，試劑穩定性好，可為染色體核型分析臨床診 斷提供強有力的依據。

本發明的細胞培養基，是將合成培養基能使細胞生存的特性和天然培養基能使細胞順 利增殖生長的特性相結合，使兩種培養基的特性都能獲得最大的發揮和最優化的組合。

本發明的人體外周血淋巴細胞培養基含下列原料成分及重量百分比：

RPMI1640液體培養基????77-81.9％