[發明專利]一種編碼產堿桿菌腈水解酶的基因及其用于制備扁桃酸單一對映體的方法

無效

• 申請號: 200910049506.0
• 申請日: 2009-04-17
• 公開（公告）號: CN101701222A
• 公開（公告）日: 2010-05-05
• 發明（設計）人: 許建和;張志鈞;劉俊峰;潘江
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/78;C12N15/63;C12N1/00;C12P7/42;C12R1/05
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司 31213
• 代理人: 鄔震中

技術領域

本發明涉及一種編碼腈水解酶的堿基序列，一種含有這種堿基序列的質粒， 以及由這種質粒轉化而得到的轉化體。本發明還涉及一種可以催化扁桃腈高效且 對映選擇性水解為(R)-(-)-扁桃酸的基因工程重組腈水解酶，以及使用這種酶由 相應的扁桃腈制備(R)-(-)-扁桃酸及其類似物的技術方法。本發明還涉及利用這 種轉化體制備(R)-(-)-扁桃酸及其類似物的方法。本發明另外還涉及通過利用腈 水解酶的轉化體、其培養物或者其加工制品來催化扁桃腈的不對稱水解制備相應 的(R)-(-)-扁桃酸單一對映體及其類似物的方法。

技術背景

扁桃酸，或稱α-羥基苯乙酸，是一種重要的手性合成中間體和大宗手性拆分 劑，在制藥行業具有廣泛的用途。相對于扁桃酸的消旋體，其單一對映體(右旋 或左旋的扁桃酸)的應用價值更高。因此，簡潔高效、低成本的扁桃酸單一對映 體的制備方法成為研究開發的熱點。

(R)-(-)-扁桃酸及其類似物是一類重要的手性合成砌塊，被廣泛地應用于多 種藥物的合成。例如，作為頭孢類半合成抗生素、抗腫瘤及抗衰老藥物的重要中 間體；也可以作為手性拆分試劑，用于拆分其他的手性藥物或醫藥中間體。

(R)-(-)-扁桃酸的化學結構式為：

傳統的化學拆分法，主要是利用手性胺類化合物，如α-甲基芐胺、(-)-麻黃 堿和辛可寧等，通過與外消旋的扁桃酸形成非對映異構體鹽的方法，得到扁桃酸 的單一對映體。還可利用色譜法、結晶法、膜法和超臨界萃取法等物理化學方法 來對扁桃酸進行對映體拆分。此外，還可利用還原劑來不對稱合成(R)-(-)-扁桃 酸。

最近，利用生物法合成(R)-(-)-扁桃酸正在逐漸成為研究的熱點。例如，專 利報道(CN?1710087，2005)以苯甲酰甲酸甲酯或苯甲酰甲酸的其它衍生物為底 物，采用酵母或白地霉等微生物細胞作為催化劑，選擇性地將底物中的羰基還原 為羥基，從而獲得以一種立體構型為主的扁桃酸單一對映體。專利(CN?1840671， 2006)以篩選到的黃色短桿菌(Brevibacterium?flavum)AS?1.818作為催化劑，不對 稱轉化外消旋的扁桃酸得到產物(R)-扁桃酸，產物的光學純度可達90％e.e.以上。 也有文獻報道利用脫氫酶選擇性降解(S)-(+)-扁桃酸而得到(R)-(-)-扁桃酸。例如， Miyamoto等(Biotechnol.Lett.，1992，14：1137-1142)利用Alcaligenes?bronchisepticus 拆分外消旋的扁桃酸，產率為42％，e.e.為97％。Jamaluddin等(J.Bacteriol.，1970， 101：786-793)利用Aspergillus?niger脫氫酶選擇性氧化外消旋的扁桃酸得到光學純 的(R)-(-)-扁桃酸。Takahashi等(J.Ferment.Bioeng.，1995，3：247-250)利用 Pseudomonas?polycolor轉化外消旋的扁桃酸，得到(R)-(-)-扁桃酸，產率為35％， e.e.為99.9％。Li?GY等(Process?Biochemistry，2007，42：1465-1469)利用殼聚糖固定 化Saccharomyces?cerevisiae來不對稱還原苯甲酰甲酸為(R)-(-)-扁桃酸，產率為 62％，e.e.為98％。

然而，上述公開報道的方法一般僅限于實驗室規模，還不適用于工業化生產 (R)-(-)-扁桃酸，主要是由于還原催化劑或拆分試劑價格昂貴，物理化學方法技 術要求嚴格，而在生物化學方法中需要先合成其轉化的前體，其步驟相當繁瑣且 反應條件劇烈，對生態不夠友好，同時還需要消耗昂貴的輔酶。

腈水解酶能夠催化有機腈化合物一步水解為羧酸并產生一分子的氨，該過程 反應條件溫和，不需要任何輔因子的參與，反應效率極高，同時反應過程具有較 好的區域和立體選擇性。另一方面，反應底物扁桃腈易于大規模生產且成本低廉； 更為重要的是，當(R)-(-)-扁桃腈被對映選擇性地酶促水解為(R)-(-)-扁桃酸后， 剩余的(S)-(+)-扁桃腈在弱堿性條件下可以自發地消旋轉化為外消旋的扁桃腈，這 樣理論上可以得到100％的產率。因此，如果能夠獲得對扁桃腈具有高水解活性 和對映選擇性的腈水解酶，則有望實現(R)-(-)-扁桃酸的大規模工業化生產。