[發(fā)明專利]一種新型抗菌脂肽及其制備和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910049291.2
• 申請(qǐng)日: 2009-04-14
• 公開（公告）號(hào): CN101602792A
• 公開（公告）日: 2009-12-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬驍駿;吳自榮;黃靜;馮震;孫昭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華東師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K5/11
• 分類號(hào): C07K5/11;C07K1/04;A61K38/07;A61P31/04;A61P31/06;A61P31/10;A61P15/02
• 代理公司: 上海金盛協(xié)力知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 董紅曼

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種新型的抗菌脂肽，并提供該抗菌脂肽的制備方法及其在抗細(xì) 菌，真菌，包括耐藥菌中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

抗生素自它產(chǎn)生以來(lái)，一直是人類感染性疾病和炎癥的克星。但是，由于抗 生素的長(zhǎng)期和高劑量使用，使許多菌株對(duì)其產(chǎn)生了耐藥性，甚至出現(xiàn)了能夠耐受 幾乎所有抗生素的“超細(xì)菌”。因此，尋找一種能夠替代抗生素的藥物迫在眉睫。

目前，能解決這一問(wèn)題的藥物主要有兩種：一種是陽(yáng)離子抗菌肽，一種是脂 肽。陽(yáng)離子抗菌肽，是具有抗菌活性短肽的總稱，是生物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具 有生物活性小分子多肽。一般由20-60個(gè)氨基酸組成，分子量在2000-7000道爾 頓左右，含有50％以上的疏水性氨基酸?？咕亩鄶?shù)具有強(qiáng)堿性，熱穩(wěn)定性以及 廣譜抗菌等特點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道至少有113種以上的不同細(xì)菌均能被抗菌肽所殺 滅，尤其對(duì)耐藥性細(xì)菌有殺滅作用。因其抗菌活性高，抗菌譜廣，種類多，可供 選擇的范圍廣，安全性高，靶菌株不易產(chǎn)生抗性突變等原因，被認(rèn)為是替代抗生 素的理想藥物。

但目前，已知的多數(shù)抗菌肽還存在著一些缺點(diǎn)，例如抗菌肽的大規(guī)模生產(chǎn)問(wèn) 題?，F(xiàn)在制備抗菌肽的方法主要有生物材料提取法、化學(xué)合成法和基因工程表達(dá) 法3種方法。抗菌肽在生物組織中含量低、分離困難、除少數(shù)幾種昆蟲抗菌肽外， 提取法制得的樣品難以滿足應(yīng)用需要?；瘜W(xué)合成法雖然可以制備一定數(shù)量的樣 品，但因?yàn)橐阎咕牡陌被釟埢鶖?shù)較多，序列比較長(zhǎng)，分子量比較大，因此 化學(xué)合成價(jià)格較為昂貴，成本較高。而利用基因工程方法雖然為抗菌肽的大量生 產(chǎn)提供了新的手段，可是此方法目前還存在技術(shù)上的困難，如表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主有 害，影響基因的高水平表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物不易分離純化等，用基因工程的方法制 備抗菌肽也不是很理想。因此如何提高抗菌肽的產(chǎn)量以及降低成本已成為目前抗 菌肽研究與應(yīng)用的瓶頸。

于是人們把目光轉(zhuǎn)向了另一種代替抗生素的藥物——脂肽。脂肽是一種兩性 分子，含有親水性的肽和疏水性的脂肪酸。脂肽一般來(lái)源于植物、動(dòng)物和微生物， 但大多數(shù)脂肽來(lái)源于微生物，而其中又以來(lái)源于細(xì)菌的脂肽居多。脂肽類化合物 兩親性的物化性質(zhì)，使其具有比抗菌肽更良好的抗菌效果。

但是細(xì)菌產(chǎn)生的脂肽種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜。即使具有同一基本結(jié)構(gòu)的脂肽也 存在多種結(jié)構(gòu)類似物。由于這些脂肽的結(jié)構(gòu)相似，從細(xì)菌發(fā)酵液中分離純化得到 單分子化合物非常困難。而多數(shù)脂肽脂肽分子中脂肪鏈部分的碳原子數(shù)一般在 12～19之間，肽鏈部分的氨基酸數(shù)目在6個(gè)以上，因此用化學(xué)合成的方法制備， 存在著成本高的問(wèn)題。目前報(bào)道的大多數(shù)脂肽成環(huán)狀，而線性脂肽僅有螺旋形素 spiroidesin及TAN?1511系列。

因此，研究新型、短序列、小分子量的線性脂肽，有利于降低成本，并為開 發(fā)代替抗生素的抗菌藥物提供更大的選擇空間。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提出一種新型的短序列抗菌脂肽，其特征在于 所述抗菌脂肽具有下列的結(jié)構(gòu)：(Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4)-R；其中，Xaa1，Xaa4 為L(zhǎng)ys或Arg中的任意一個(gè)；Xaa2，Xaa3為Ala，Gly，Leu或Glu中的任意一 個(gè)，且Xaa2、Xaa3之其中一個(gè)為D型氨基酸；R為具有n個(gè)C的脂肪酸鏈， 其中n＝8，12，或16。這種抗菌脂肽的短肽僅由4個(gè)氨基酸組成，且該脂肽的分 子量?jī)H在700道爾頓左右。

本發(fā)明解決的另一技術(shù)問(wèn)題是提供上述抗菌脂肽的制備方法。

固相化學(xué)合成法在制備少于20個(gè)氨基酸的小肽工藝十分成熟，具有快速、 純化簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的技術(shù)方案選用固相化學(xué)合成法按該脂肽的序 列合成線性脂肽。其技術(shù)方案概括如下：先將樹脂溶張，然后以加入被保護(hù)的氨 基酸單體，脫保護(hù)，檢測(cè)，縮合為一個(gè)循環(huán)，按照序列依次連入氨基酸，再以同 樣的方法連入脂肪酸鏈，得到多肽樹脂。再將所要的脂肽從樹脂上切割下來(lái)，經(jīng) HPLC進(jìn)行分離純化，再經(jīng)冷凍干燥后得到脂肽。

現(xiàn)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。

一種新型抗菌脂肽的固相化學(xué)合成方法，具體操作如下：

第一步：樹脂溶漲

將一定量的RinkAmide-MBHARisin樹脂放入反應(yīng)管中，加入DMF使其振 蕩。

第二步：接入第一個(gè)氨基酸