[發明專利]環狀異帽藻鑒定方法

無效

• 申請號: 200910048128.4
• 申請日: 2009-03-24
• 公開（公告）號: CN101845484A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 張鳳英;馬凌波;鄭俊斌;馬春艷;蔣科技;張凊漪;石彥紅;張永;楊柯
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院東海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/89
• 代理公司: 上海東方易知識產權事務所 31121
• 代理人: 歐陽俊立

技術領域

本發明涉及為赤潮預測預報提供依據的藻種鑒定。

背景技術

目前用于鑒別赤潮藻類的引物通常為通用型引物，如利用微藻的核糖體5.8S?rDNA、18S?rDNA、28S?rDNA、ITS區基因序列相對保守區域所設計的引物，這種引物能夠適用于真核生物或者甲藻門藻類，范圍比較大，作為初次鑒定較為方便，但由于其專一性不強，無法一次性定位到具體的藻種，因此難以達到赤潮藻鑒定的要求。而且采用通用引物經聚合酶鏈式反應(PCR)實驗后，獲得產物序列需通過基因測序，分析后方能明確其所屬種類。這種方法過程步驟較多，耗時、耗費大量的費用，且無法適用在缺乏測序條件之時。因此，開發針對性較強的引物是當前的研究熱點，查閱最新發表的研究報告，已有專家利用核糖體18S?rDNA、葉綠體rbcl等基因序列設計出鑒別單類藻種的引物探針，一次性PCR擴增就能鑒定到位，無需測序，大大縮短了鑒定周期，同時節省了大量的費用。

發明內容

本發明需要解決的問題是提供一種環狀異帽藻聚合酶鏈式反應鑒定特異性引物，以便為赤潮的預測預報提供依據。

本發明通過藻種培養、總DNA提取，其特征是利用Primer?5.0軟件對環狀異帽藻(Heterocapsa?circularisquama)核糖體轉錄間隔區(ITS區)設計了專一性鑒定引物YiF3a和YiB3a，

引物序列為YiF3a：GCAGCGAAGTGTGATAAGCAT；

YiB3a：AATAGGGAAGGGCTAACCATCA；

基因組DNA經PCR擴增后，直接通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗有特異條帶擴增確定為環狀異帽藻。

本發明專門用于鑒定環狀異帽藻，對其他藻種具有排他性，經PCR擴增后，無需基因測序，直接通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗，便能確定為環狀異帽藻，操作簡單，特別適合于在具有普通PCR儀的一般實驗室里操作。

具體實施方式

本發明實驗按如下步驟進行：

(1)藻種培養：研究對象是環狀異帽藻(Heterocapsa?circularisquama)。對照藻有米氏凱倫藻(Karenia?mikimotoi)，塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium?tamarense)，鏈狀亞歷山大藻(A.catenella)，微小亞歷山大藻(A.minutum)，微小原甲藻(Prorocentrum?minimum)，利瑪原甲藻(Prorocentrum?lima)。培養基采用天然海水，按照不含硅酸鹽的f/2配方配制，其中氮、磷濃度按實驗要求另加。培養基經121℃高壓蒸汽滅菌20min后備用。培養溫度為(25±1)℃，以日光燈為光源，光照強度為100lx，光暗比為12h∶12h。

(2)總DNA提取：離心收集處于指數生長期環狀異帽藻細胞，用改良CTAB法提取基因組總DNA，酚、氯仿抽提純化。

(3)引物設計：根據GenBank中環狀異帽藻的ITS基因序列(AF183473)，對照不同屬、科、目、綱的多種其他藻種ITS區序列，找尋特征性基因序列，利用Primer?5.0軟件設計，篩選出多對引物，通過PCR實驗，確定最佳引物為YiF3a：GCAGCGAAGTGTGATAAGCAT和YiB?3a：AATAGGGAAGGGCTAACCATCA。

(4)PCR擴增：采用設計引物對環狀異帽藻和幾種對照藻種基因組DNA進行PCR擴增，反應條件為：95℃預變性5min后進行30個循環，每個循環包括94℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，最后于72℃延伸10min，4℃保存。

(5)電泳檢驗：PCR產物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統拍照，檢驗條帶結果是否具有專一性，只有環狀異帽藻有特異條帶擴增，其他對照藻均為陰性。