[發明專利]采用轉喜樹aoc基因提高喜樹愈傷組織中喜樹堿含量的方法

無效

• 申請號: 200910047611.0
• 申請日: 2009-03-13
• 公開（公告）號: CN101831456A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 孫小芬;皮妍;蔣科技;唐克軒
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 吳桂琴

1.一種采用轉喜樹aoc基因提高喜樹愈傷組織中喜樹堿含量的方法，其特征在于，從喜樹中克隆丙二烯氧化物環化酶AOC基因，構建含aoc基因的植物表達載體，用根癌農桿菌介導，將aoc基因導入喜樹幼胚并誘導出愈傷組織，PCR和半定量RT-PCR檢測外源目的基因aoc的整合和表達情況，利用高效液相色譜法測定喜樹愈傷組織中喜樹堿的含量，篩選喜樹堿含量提高的轉基因喜樹愈傷組織。

2.根據權利要求1所述的采用轉aoc基因提高喜樹愈傷組織中喜樹堿含量的方法，其特征是，包括如下具體步驟：

(1)采用基因克隆方法獲得喜樹關鍵酶基因aoc；

(2)把aoc基因可操作性地連于表達調控序列，形成含aoc基因的植物表達載體；

(3)將含aoc基因的植物表達載體轉化根癌農桿菌，獲得用于轉化喜樹的含aoc基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株；

(4)利用所構建的根癌農桿菌菌株轉化喜樹幼胚，獲得經PCR檢測的轉基因愈傷組織；

(5)半定量RT-PCR測定喜樹愈傷組織中aoc基因的表達；

(6)對獲得的轉基因愈傷組織中生物堿含量進行高效液相色譜檢測儀測定，篩選喜樹堿含量提高的轉基因喜樹愈傷組織。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征是，所述的經PCR檢測的轉基因愈傷組織，其中：設計合成aoc基因的引物，進行DNA擴增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性愈傷組織即為轉基因喜樹愈傷組織。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征是，所述的對獲得的轉基因愈傷組織中生物堿含量進行高效液相色譜法檢測器測定，其中：色譜柱為Diamonsil?C18柱，流動相為乙腈∶水，乙腈∶水的體積比為4∶6，柱溫25℃，流速0.8mL/min，進樣量10μL，壓力7.8Mpa，喜樹堿含量根據峰面積由標準品曲線換算。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征是，所述的半定量RT-PCR測定喜樹愈傷組織中aoc基因的表達，通過下述步驟：設計合成aoc基因和看家基因18S?rRNA的引物，進行半定量RT-PCR擴增，用相對定量法分析基因相對表達量。