[發明專利]HBVcccDNA核酸定量檢測試劑盒及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 200910047009.7
• 申請日: 2009-03-04
• 公開（公告）號: CN101503740A
• 公開（公告）日: 2009-08-12
• 發明（設計）人: 邵俊斌;沈步超
• 申請（專利權）人: 上海之江生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64;C12R1/93
• 代理公司: 上海光華專利事務所
• 代理人: 許亦琳;余明偉

技術領域

本發明涉及核酸檢測試劑盒，具體涉及熒光PCR法HBV?cccDNA核酸定量檢測試劑盒及其制備方法與應用。

背景技術

HBVcccDNA(共價閉合環狀乙型肝炎病毒)是乙型肝炎病毒在人的肝細胞核中存在的形式。當乙型肝炎病毒(HBV)進入人體后，隨血液循環進入肝臟侵入肝細胞。病毒進入肝細胞后，其蛋白成分留在細胞外，其DNA直接進入人的肝細胞核，通過人體的RNA聚合酶II將其負鏈的缺口修補成為完整的環，然后折疊成超螺旋結構，就成為共價(covalence)、閉合(close)、環狀(cycle)的DNA，取三個英文字頭，即為cccDNA。cccDNA又是制造乙型肝炎病毒的模板，而且又長時間躲在肝細胞核內，不容易清除，所以有的帶毒者即使是血清內的HBV?DNA已經消失，但其肝細胞核內尚有cccDNA存在，它就會繼續制造HBV?DNA和乙肝病毒抗原，裝配成乙肝病毒(HBV)入血，使乙型肝炎帶毒者血清內又現HBV?DNA及各種抗原陽性。所以它是使得乙型肝炎帶毒者長期攜帶病毒，而不能輕易治愈的罪魁禍首。也就是說，HBV?cccDNA實際是乙型肝炎病毒攜帶者的一個看不見打不著的最隱蔽的敵人。因此檢測HBV?cccDNA對乙型肝炎的治療有著重大意義。

過去報道檢測HBVcccDNA的方法并不適合臨床檢測使用，因為這些方法需要涉及凝膠電泳、核酸轉膜、同位素探針雜交、多次洗滌、同位素成像等程序。操作人員很難掌握每一個技術環節和操作細節，實驗的重復性也不好，而且費時。經典方法Southern?blot的定量范圍和靈敏度也非常有限。

實時熒光定量PCR技術使基因擴增、分子雜交和光化學融為一體。PCR擴增和產物分析的全過程均在單管封閉條件下進行，并通過微機控制，實現了對PCR擴增產物進行實時動態檢測和結果自動分析。Taqman熒光PCR技術是在常規PCR技術基礎上添加了一條熒光雙標記的探針，一個標記在探針的5’端，稱為熒光報告基因(R)，另一個標記在探針的3’端，稱為熒光淬滅基因(Q)，兩者可構成能量傳遞結構，即5’端熒光基因所發出的熒光可被另一熒光基因吸收或者抑制。探針的3’端羥基(-OH)已被去除或者封閉，不具有延伸能力。探針在無特異性PCR發生時，熒光信號不改變。當有特異性PCR擴增發生時，探針會在PCR過程中被Taq酶的5’--3’外切酶活性作用而切斷，抑制作用消失，從而引起報告基因熒光信號增長。隨著PCR的過程的進行，熒光信號伴PCR產物的增長而增長。熒光PCR就是利用此原理，在PCR反應前后，分析檢測反應中特定熒光信號的變化，得到信號增強值，再利用試驗確定的信號增強闡值，即可以判別樣品的陰陽性。熒光檢測所獲得Ct值(cycle?threshold)與擴增前樣品中模板數對數值成線形負相關。據此建立標準曲線，可以定量分析樣品中目的基因數量。

實時熒光定量PCR方法雖然非常靈敏，而且操作簡便，但是關鍵點在于，必須把HBVcccDNA和其他非cccDNA形態區分開，否則失去特異性檢測HBV?cccDNA的價值，但現有技術中尚缺乏這樣的設計。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測共價閉合環狀乙型肝炎病毒(HBVcccDNA)核酸定量檢測試劑盒(熒光PCR法)及其制備方法與應用，解決了現有技術檢測HBVcccDNA難的難題，為臨床診斷病人提供依據。

本發明的檢測原理：

HBVcccDNA與Dane顆粒中DNA以及病毒其他復制中間體核酸形式是有區別的，根本區在于HBVcccDNA是完整的DNA雙鏈，而HBV非cccDNA核酸形態在DR1和DR2區域附近存在缺口。利用該區別點，建立一種選擇性檢測HBVcccDNA的方法。本發明利用非cccDNA在DR1和DR2區域存在的一個斷端的特點，設計一條由兩種無同源性序列組成的引物，引物3’端與HBV核酸斷端前的部分序列互補配對，做單鏈延伸反應，生成一條5’端帶有無關序列的HBV單鏈，再以此無關序列作為下一個PCR反應的引物，以保證后面PCR擴增的模板僅來源與5’端帶有無關序列的HBV單鏈。由于非cccDNA在DR1和DR2處有斷端，所以單鏈無法有效延伸，致使后面PCR中，HBV特異性引物無法與新單鏈結合，也就不能形成PCR過程中指數擴增。這樣就有效區分了HBV?cccDNA和其他非cccDNA。