[發明專利]一種乳酸鏈球菌素的HPLC檢測方法

有效

• 申請號: 200910045204.6
• 申請日: 2009-01-13
• 公開（公告）號: CN101776665A
• 公開（公告）日: 2010-07-14
• 發明（設計）人: 蔣家琛;趙文杰;魏曉東;顧敏;程晴華;趙波
• 申請（專利權）人: 上海醫藥工業研究院
• 主分類號: G01N30/34
• 分類號: G01N30/34
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 張睿

技術領域

本發明涉及發酵液中目標產物的檢測，尤其涉及一種乳酸鏈球菌素的高效 液相色譜(High?Performance?Liquid?Chromatography，HPLC)檢測方法。

背景技術

乳酸鏈球菌素(Nisin，又稱乳球菌肽或乳鏈菌肽)是由乳酸鏈球菌 (Lactococcus?lactis?ssp.lactis)在代謝過程中合成和分泌的具有較強抑菌 作用的小分子肽，也是目前研究最多、應用較廣的細菌素之一。Nisin是目前在 國際上允許商業化生產的少數天然食品防腐劑之一，廣泛應用于乳制品、發酵 飲料、罐藏食品、肉類及肉制品的防腐保鮮，它能夠有效抑制引起食品腐敗變 質的革蘭氏陽性細菌(G⁺)及病原菌的繁殖。與其他防腐劑相比，Nisin是由天 然存在的Lactococcus菌產生且對蛋白酶特別敏感，在消化道中很快被α-胰凝 乳蛋白酶分解。因此它對人體基本無毒性，也不與醫用抗生素產生交叉抗藥性， 能在腸道中無害地降解。其結構見圖1。

Nisin于1928年被Rogerst?Whittier首先發現。最早實現工業化生產的 是英國Aplin&Berrett公司，隨后美國、英國等50多個國家和地區也相繼批 準Nisin為天然食品防腐劑。我國對Nisin的研究始于1989年。我國實現工 業化生產的菌種L.laticsAL2產生的是NisinZ。1990年，Nisin被列入我國國 標GB2780-86的1990年增補品中。

早期，在Tramer等提出瓊脂擴散法之前，人們普遍采用的是試管稀釋技術 和濁度測定法(Turbidity?Assay)。1964年Tramer和Fowler建立了瓊脂擴散 法的基本方法，但由于nisin的分子量較大，酸性條件下溶解性較好，而在中 性環境下溶解度很小，所以很難在瓊脂中擴散。后來Wolf等進一步對瓊脂擴 散法進行了優化。他們優化的參數有：指示菌、瓊脂的深度和濃度、Tween20 的濃度、培養基中所加的緩沖劑等。Wolf等的改進方法與Tramer等的最初的 方法相比，精確度提高了57％，準確性提高了12％，因此目前用于檢測食品中乳 鏈菌肽含量的最常用的方法是瓊脂擴散法(分析檢驗食品科學2005，Vol.26， No.7175，管碟法測定nisin效價的改進；食品科學2007，Vol.28，No.03175， 瓊脂擴散法測定乳鏈菌肽效價的優化；國外醫藥抗生素分冊2004年9月第25 卷第5期，細菌素Nisin的檢測方法)。

HPLC與瓊脂擴散法比較具有快速，準確，重復性好等優點。現有HPLC技術 提到用RP-HPLC?Hi-Pore?RP-318(BioRad)、250×10mm的柱，在30℃使用流動 相A為10％(V/V)乙腈添加0.1％三氟乙酸，流動相B為90％乙腈添加0.07％三 氟乙酸梯度洗脫。流動相B的起始濃度為25％終止濃度為28％，且在梯度洗脫 中濃度的變化為逐漸遞增的(Eur.J.Biochem.201，581-584，1991， Identification?and?characterization?of?the?lantibiotic?nisin?Z，a natural?nisin?variant)。用此方法分析樣品的時程長，近1小時，梯度洗脫 基線漂移，造成積分困難，樣品測定結果的重現性、準確性等差。發明人按該方 法而HPLC譜中沒有目標峰。

因此，本領域迫切需要提供一種運行時間短、基線穩定、分離度良好的檢 測乳酸鏈球菌素的HPLC方法。

發明內容

本發明旨在提供一種乳酸鏈球菌素的高效液相檢測方法。

在本發明中，提供了一種乳酸鏈球菌素的檢測方法，所述的檢測方法為高效液 相色譜(High?Performance?Liquid?Chromatography，HPLC)，其流動相中含有乙 腈和水，乙腈的起始濃度為5-25vol.％，最終濃度為35-100vol.％。

在另一優選例中，流動相中的乙腈在15-40分鐘從5-25vol.％遞增至35- 100vol.％。

在另一優選例中，流動相中的乙腈在20-35分鐘從10-22vol.％遞增至35- 80vol.％。