[發明專利]cyp7lav1基因啟動子

有效

• 申請號: 200910045041.1
• 申請日: 2009-01-08
• 公開（公告）號: CN101475935A
• 公開（公告）日: 2009-07-08
• 發明（設計）人: 唐克軒;王鵫月;唐岳立
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/82
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術領域

本發明涉及的是一種基因工程技術領域的基因啟動子，具體是一種cyp71av1基因啟動子。

背景技術

青蒿(Artemisia?annua?L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。青蒿素是從其地上部分分離出的一種含有過氧橋結構的倍半萜內酯化合物，是目前世界上公認的最有效的治療瘧疾藥物，特別是對腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾更加有效。目前，世界衛生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法就是青蒿素聯合療法(ACTs)。另外，隨著對青蒿素藥理研究的逐步深入，科學家發現青蒿素及其衍生物還具有抗炎、抗血吸蟲、抗腫瘤以及免疫調節的功能，可見青蒿素是一種極具潛力的天然藥物。

目前青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，為0.01％-1％，低含量使得青蒿素的大規模商業化生產受到了限制。由于青蒿素結構復雜，人工合成難度大、產量低、成本高，因此人工生產缺乏可行性。也有人嘗試用組織培養和細胞工程的方法來生產青蒿素，然而青蒿素在愈傷組織中的含量低于干重的0.1％，在芽中含量最高也只有干重的0.16％，大多數研究沒有檢測到青蒿素。因此，利用組織培養及細胞工程來生產青蒿素的也不具備可行性。DahuaChen等在《Plant?Science》(植物科學)2000年155期179-185頁發表了題為“Expression?of?a?chimeric?farnesyl?diphosphate?synthase?gene?in?Artemisiaannua?L.transgenic?plants?via?Agrobacterium?tumefaciens-mediatedtransformation”(通過農桿菌介導轉化在青蒿植株中表達法尼基焦磷酸合酶基因)的論文，文中評述，通過過量表達法尼基焦磷酸合酶(farnesyl?diphosphatesynthase，FPS)可在原有基礎上提高青蒿素含量2倍-3倍，達到1％左右。

cyp71av1是從青蒿腺毛特異cDNA文庫中分離出的一個編碼細胞色素P450單加氧酶的基因。研究表明CYP71AV1催化從紫穗槐二烯到青蒿酸的三步氧化反應，在青蒿素生物合成途徑中起到重要作用。隨著青蒿素生物合成途徑的逐漸清晰，采用基因工程手段提高青蒿中青蒿素含量具有非常大的潛力，例如過量表達代謝途徑中的青蒿素合成途徑關鍵酶編碼基因被證實是一種提高青蒿素含量的有效方法。在青蒿基因工程研究中，目前所采用的啟動子大多數是組成性的啟動子，例如煙草花葉病毒35S啟動子(CaMV35)。這種啟動子能夠驅動外源基因在所有的組織和器官中表達，可能會對植物的正常生長造成一定的負擔和危害。由于腺毛不是植物生長所必需的，利用腺毛特異表達的啟動子對植物的腺毛系統進行遺傳操作不會對植物的生長發育造成危害。先前的研究表明cyp71av1基因在青蒿腺毛中大量表達，而在其它組織中表達量很低，這暗示cyp71av1的啟動子很可能是腺毛特異表達的啟動子。因此，克隆cyp71av1基因的啟動子對利用植物腺毛組織表達和生產代謝產物的基因工程育種具有重要意義。另外，cyp71av1基因的表達極大地受ABA誘導。克隆其啟動子將為研究cyp71av1基因的表達調控、分析啟動子上的順式作用元件以及尋找ABA應答相關的轉錄因子奠定基礎。

經對現有技術文獻的檢索發現，尚未發現有與本發明的cyp71av1基因啟動子序列相關的報道。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種cyp71av1基因啟動子。本發明的基因啟動子能引導基因在轉基因植物腺毛中特異表達。

本發明是通過以下技術方案實現的，

本發明涉及一種cyp71av1基因啟動子，該啟動子具有序列表中SEQ?ID?NO.1的2100bp的核苷酸序列。

所述cyp71av1基因啟動子能引導基因在植物腺毛中特異表達。

所述cyp71av1基因啟動子能在利用植物腺毛組織表達和生產代謝產物的基因工程育種中應用。

本發明涉及的cyp71av1基因啟動子得到的步驟具體如下：

步驟一，培養青蒿無菌苗；

步驟二，采用CTAB法提取青蒿總DNA；

步驟三，TAIL-PCR法克隆啟動子基因組序列；

步驟四，Genomic?DNA?Walking法克隆啟動子基因組序列；

步驟五，用RACE法確定轉錄起始位點；

步驟六，分析啟動子上的順式作用元件，確定cyp71av1基因啟動子的類型；