[發明專利]CD11a、CD70基因甲基化水平定量檢測方法

無效

• 申請號: 200910044721.1
• 申請日: 2009-11-06
• 公開（公告）號: CN101724691A
• 公開（公告）日: 2010-06-09
• 發明（設計）人: 陸前進;張秀娟;周東蕊;陸祖宏
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B40/06
• 代理公司: 中南大學專利中心 43200
• 代理人: 胡奕

技術領域

本發明涉及用于系統性紅斑狼瘡早期診斷的基因芯片，還涉及基因甲基化定量檢測方法。?

背景技術

系統性紅斑狼瘡(Systemic?Lupus?Erythematosus，簡稱SLE)是一種多器官、多系統受累的自身免疫性疾病。作為一種典型的嚴重危害人類健康的自身免疫性疾病，其病因和發病機制非常復雜，醫學界至今尚不十分清楚。目前，SLE的診斷主要依賴臨床表現和實驗室檢查，臨床表現包括如面頰部蝶形紅斑等，實驗室檢查主要有狼瘡帶試驗、抗核抗體譜等。但根據臨床表現及實驗室檢查確診時，患者往往已多器官系統受累。因此，如果能將SLE的診斷上升到基因水平，找到一種能用于臨床的快速診斷工具，則能對該疾病的早期診斷和盡早干預起到重要作用。?

發明人的研究表明：T細胞DNA低甲基化在SLE發病中起重要作用，這種低甲基化在CD11a(又稱ITGAL，GeneID：3683；HGNC6148)和CD70(GeneID：970；HGNC：11937)這兩個基因中表現明顯。近些年來對SLE發病機制的研究表明SLE患者CD₄⁺T細胞中CD11a和CD70兩個基因的特定CpG位點處于低甲基化狀態，其甲基化改變及模式有望成為極具前途的SLE早期診斷標志。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于SLE早期診斷的DNA芯片。?

本發明進一步目的在于提供一種檢測待檢樣品中紅斑狼瘡相關基因CD11a和CD70甲基化水平的方法。?

本發明用于診斷紅斑狼瘡的DNA芯片由基片和固定于基片上的探針組成，所述探針由針對CD70或/和CD11a的CpG位點而設計的寡核苷酸序列組成，每個基因設計一對區分甲基化與非甲基化的探針，采用氨基對每個探針5’末端進行活性基團的標記，固定DNA的基片用醛基修飾。?

所述針對CD70或/和CD11a的CpG位點而設計的探針具體核苷酸序列為：?

CD11a-M：5’NH₂-(T)₁₀-TTATCGTATTAGGTCGTTTA；?

CD11a-U：5’NH₂-(T)₁₀-TTATTGTATTAGGTTGTTTAA；?

CD70-M：5’NH₂-(T)₁₀-ATACGCGCGCCACGATAC；?

CD70-U：5’NH₂-(T)₁₀-AACATACACACACCACAATAC。?

上述的DNA芯片的每個探針最好橫向重復6次。?

本發明檢測待檢樣品中CD11a和CD70甲基化水平的方法包括步驟：(1)分別建立CD70和CD11a熒光強度的標準化曲線：針對CD11a和CD70基因分別建立甲基化的陽性與陰性質控品，陽性與陰性質控品按質量比0∶1、1∶3、1∶1、3∶1、1∶0混合，5組質控品混合物分別與本發明的DNA芯片雜交，得到熒光圖譜和熒光強度數據；陽性質控品雜交的熒光強度標記為M，陰性質控品雜交的熒光強度標記為U；以M/(M+U)為縱坐標，甲基化陽性產物在總產物中的百分比為橫坐標，分別得到CD70和CD11a基因甲基化的標準曲線方程【A：CD70：y＝0.925x+0.017(R²＝0.9912)】和【B：CD11a：y＝0.933x-0.014(R^2＝0.9832)】；(2)取待檢樣品血，分選CD₄⁺T細胞，提取DNA，對抽提出的DNA進行亞硫酸氫鈉轉化處理，用熒光標記引物分別進行巢式PCR擴增，將PCR產物分別與本發明的DNA芯片進行雜交，分別讀取熒光信號強度Y，將其分別帶入上述CD70和CD11a的熒光強度標準曲線中，分別計算出X即為待檢樣本CD70和CD11a基因的甲基化百分比。?