[發(fā)明專(zhuān)利]堆肥中生物酶基因多樣性的分析方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910043399.0
• 申請(qǐng)日: 2009-05-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101550449A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-10-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范長(zhǎng)征;曾光明;楊春平;梁婕;楊朝暉;李鳳;李貞;肖勇
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 湖南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;G01N27/447;G01N21/78
• 代理公司: 湖南兆弘專(zhuān)利事務(wù)所
• 代理人: 趙 洪

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基因多樣性的方法，尤其涉及一種堆肥微生物總DNA中基因多樣性的 分析方法。

背景技術(shù)

堆肥是利用微生物對(duì)可生物降解固體廢物進(jìn)行分解，從而對(duì)其實(shí)現(xiàn)最終處理的一種系統(tǒng)， 因此，充分認(rèn)識(shí)其中的微生物學(xué)原理能為改進(jìn)處理工藝、提高處理效率提供依據(jù)。對(duì)堆肥進(jìn) 行微生物群落研究的傳統(tǒng)方法主要是微生物培養(yǎng)和純種分離技術(shù)。因?yàn)榄h(huán)境中的絕大多數(shù)微 生物無(wú)法通過(guò)培養(yǎng)方法進(jìn)行研究，而且堆肥中微生物種類(lèi)繁多，常處于動(dòng)態(tài)變化狀態(tài)，培養(yǎng) 研究無(wú)法反映系統(tǒng)中微生物種群的動(dòng)態(tài)變化，因此，這樣的研究方法無(wú)法滿足堆肥微生物學(xué) 研究的要求。

分子生態(tài)學(xué)技術(shù)正是一種能不依賴(lài)于微生物分離培養(yǎng)而對(duì)其進(jìn)行研究的新技術(shù)。目前， 分子生態(tài)學(xué)研究已經(jīng)涉及到環(huán)境科學(xué)研究的眾多領(lǐng)域，包括在堆肥微生物分子生態(tài)學(xué)方面的 研究。變性梯度凝膠電泳(denaturing?gradient?gel?electrophoresis，DGGE)正是其中應(yīng)用最為 廣泛的一項(xiàng)技術(shù)，其原理是：DNA進(jìn)行電泳時(shí)使用具有化學(xué)變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠， 該凝膠能夠有區(qū)別地解鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。長(zhǎng)度相同而在堿基序列上存在差異的不同DNA在 進(jìn)行變性梯度凝膠電泳時(shí)，會(huì)在各自相應(yīng)的變性劑濃度下變性，發(fā)生空間構(gòu)型的變化。DNA 雙鏈一旦解鏈，DNA分子形成端部的叉狀或中間的環(huán)形，其在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度 將會(huì)急劇下降；以至停留在其相應(yīng)的不同變性劑梯度位置，染色后可以在凝膠上呈現(xiàn)為分開(kāi) 的條帶，這樣便能將具有相同長(zhǎng)度而序列有差異的DNA分子分離開(kāi)。該技術(shù)可以分辨具有 相同或相近分子量的目的片段序列差異，可以用于檢測(cè)單一堿基的變化和遺傳多樣性以及 PCR擴(kuò)增DNA片段的多態(tài)性。

目前，對(duì)環(huán)境中功能基因的分離和多樣性的研究還要結(jié)合構(gòu)建克隆文庫(kù)的方法，但是該 方法卻不適合對(duì)堆肥過(guò)程中多種功能基因的分離和多樣性的研究，其原因在于：構(gòu)建一個(gè)克 隆文庫(kù)必須一次性挑取幾十甚至上百個(gè)克隆子，而堆肥又是一個(gè)不斷變化的動(dòng)態(tài)過(guò)程，因此， 如果要對(duì)堆肥過(guò)程中的多個(gè)功能基因進(jìn)行分離以及進(jìn)行后續(xù)的多樣性研究就必須構(gòu)建多個(gè)克 隆文庫(kù)，這不僅大大增加了工作量，一定程度上還會(huì)增加實(shí)驗(yàn)成本。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高通量、低成本、簡(jiǎn)便直觀 的堆肥中生物酶基因多樣性的分析方法，以便于更好地表征堆肥中具有降解功能(例如木質(zhì) 素的降解等)的微生物種群。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種堆肥中生物酶基因多樣性的分析方 法，包括以下步驟：首先提取堆肥中的微生物總DNA，該微生物總DNA的提取過(guò)程又包括 樣品的脫腐、DNA的粗提和DNA的純化三個(gè)步驟；然后利用PCR擴(kuò)增程序?qū)μ囟ㄉ锩富? 因進(jìn)行擴(kuò)增；再在1×TAE緩沖液中，60℃恒溫、100V恒壓條件下運(yùn)行變性梯度凝膠電泳 12～14h；最后對(duì)變性梯度凝膠電泳圖譜進(jìn)行分析，確定所述堆肥中特定生物酶基因的多樣性。

上述的堆肥中生物酶基因多樣性的分析方法，具體包括以下步驟：

(1)提取堆肥中的微生物總DNA

樣品的脫腐：向待提取DNA的堆肥樣品中以8～15ml/g堆肥的用量加入去腐緩沖液，然后 置于60～65℃的水浴中保溫3～8min，保溫期間可將樣品與去腐緩沖液輕輕攪勻，再以 3000～5000×g離心5～7min，去上清；重復(fù)本步驟直至離心后的上清顏色與所述去腐緩沖液的 顏色無(wú)明顯差異(一般重復(fù)1～2次即可滿足要求)；