[發明專利]人類胚胎干細胞無飼養細胞培養體系培養基及培養方法

無效

• 申請號: 200910042531.6
• 申請日: 2009-01-16
• 公開（公告）號: CN101475934A
• 公開（公告）日: 2009-07-08
• 發明（設計）人: 盧光琇;林戈;羅樹偉
• 申請（專利權）人: 湖南惠霖生命科技有限公司
• 主分類號: C12N15/08
• 分類號: C12N15/08
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司
• 代理人: 盧 宏

技術領域

本發明涉及一種干細胞無飼養細胞無外源細胞因子培養體系的組成。

本發明還涉及一種干細胞的培養方法。

背景技術

目前，無論是hESCs所采用的主要培養體系都是和成纖維細胞共培養的方式^[1]，成纖維細胞所分泌的細胞因子對于胚胎多能性的維持起著至關重要的作用，國內外學者已經從成纖維細胞條件化培養基中鑒定出部分對維持胚胎干細胞未分化具有重要作用的細胞因子，其中就包括了Wnt信號通路配體Wnt3a^[2]，但是單獨使用Wnt3a并不能維持hES處于未分化狀態^[3]，成纖維細胞可能還分泌了其他的細胞因子，如FGF2，Nodal，Activin?A等。隨著人類胚胎干細胞無飼養細胞培養體現的建立，研究者發現Wnt信號通路抑制劑BIO或高劑量的FGF2可以維持人類胚胎干細胞體外培養^[4，5]，同時有研究表明人類胚胎干細胞可以分化成成纖維樣細胞，這些成纖維樣細胞可以分泌IGF2來維持人類胚胎干細胞的未分化狀態，人類胚胎干細胞可以為自身建立一個維持未分化狀態的微環境^[6]，這是人類胚胎干細胞為自身未分化狀態維持的間接作用，但是人類胚胎干細胞作為培養體系的組成部分，人類胚胎干細胞直接對自身未分化狀態的影響未見報道。由于人類胚胎干細胞高表達FGF2，Nodal以及IGF2基因^[7，8]，人類胚胎干細胞自分泌作用在自身未分化狀態維持中具有重要影響。在2006年，國外學者Yao等同時采用了一種新的無飼養細胞培養體系，其加入的FGF2濃度由以往的40ng/ml降低到20ng/ml^[9]。該文獻公開的無飼養細胞培養體系是：DMEM/F12，1×N2，1×B27，0.1mM?β-ME，1×glutamine，在培養基中加入了胎牛血清，FGF2濃度為20ng/ml，同時采用的是Matrigel預鋪皿，沒有涉及克隆密度問題。

發明內容

本發明的目的是提供一種新的人類胚胎干細胞無飼養細胞無外源細胞因子培養體系培養基，并用此培養基培養干細胞。

本發明提供的人類胚胎干細胞無飼養細胞無外源細胞因子培養體系培養基是由下列成分組成的：DMEM/F12，1×N2，1×B27，0.1mM?β-ME。

本發明還公開了基于該培養基的培養人類胚胎干細胞的方法。即通過提高克隆種植密度可以在該培養體系維持人類胚胎干細胞不分化，并進行擴增。每個底面積為2.89cm²的孔板內克隆數目種植數目分別為80-120個。

在本人類胚胎干細胞無飼養細胞無外源細胞因子培養體系下，人類胚胎干細胞仍然保持了未分化特征，免疫細胞化學染色顯示該體系下克隆為Oct4，SSEA-4和TRA-1-60陽性克隆(圖1)，表達了多能性基因Oct4，Sox2，Nanog和Rexl(圖2)，AKP染色陽性(圖4)，在形態上保持了未分化外觀：克隆內細胞排列緊密，細胞維持高核質比(圖3)。

在本發明培養條件下的干細胞體系下，只要克隆種植密度維持在高水平狀態，人類胚胎干細胞就可以維持未分化狀態擴增，并且不存在背景分化現象，可以大規模擴增人類胚胎干細胞。由于在體系中不含有外源性的細胞因子，所以具有培養成本低廉的特定，同時，為闡明人類胚胎干細胞未分化狀態提供了技術平臺。

附圖說明

圖1免疫細胞化學染色顯示該體系下克隆為Oct4，SSEA-4和TRA-1-60陽性克?。?/p>

圖2本發明培養條件下的干細胞體系表達了多能性基因Oct4，Sox2，Nanog和Rexl；

圖3本發明培養條件下的干細胞體系在形態上保持了未分化外觀：克隆內細胞排列緊密，細胞維持高核質比；

圖4本發明培養條件下的干細胞體系AKP染色陽性。

具體實施方式

方法和步驟：

1、人類胚胎干細胞無飼養細胞無外源細胞因子培養體系培養基配方(NB培養基)；

利用DMEM/F12(11330057，DMEM?NUTRIENT?MIX?F12，Gibco)N2?SUPPLEMENT(17502048，100×，Gibco)，B27?SUPPLEMENT(17504044，50×，Gibco)，β-ME(β-mercaptoethanol，Gibco)配置本發明提供的培養基：DMEM/F12，1×N2，1×B27，0.1mMβ-ME。