[發明專利]抑制人KCTD1基因表達的siRNA及其在制藥中的應用

無效

• 申請號: 200910042407.X
• 申請日: 2009-01-04
• 公開（公告）號: CN101481688A
• 公開（公告）日: 2009-07-15
• 發明（設計）人: 張健;丁小鳳;周建林;向雙林;胡翔;韓梅
• 申請（專利權）人: 湖南師范大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C07H21/02;A61K31/713;A61P35/00;A61P15/14
• 代理公司: 長沙永星專利商標事務所
• 代理人: 周 詠;米中業

技術領域：

AP-2之間存在著直接的相互作用，而相互作用區域定位于AP-2的激活結構域和KCTD1保守的BTB/POZ結構域。細胞免疫熒光也表明兩蛋白的定位完全重疊，都定位于細胞核中。并且發明人還發現在MDA-MB-453細胞中KCTD1強烈地抑制了AP-2的轉錄激活，而其它BTB/POZ蛋白(如PDIP1家族三個成員)并不影響AP-2的轉錄活性。因此如何根據KCTD1的這些特性來降低其轉錄抑制功能，從而達到抑制乳腺癌細胞的增殖進而抑制腫瘤是目前亟待解決的問題。

背景技術：

本發明的目的一是提供一種特異性抑制人KCTD1基因表達的siRNA，二是能產生上述siRNA的表達載體；三是上述siRNA或siRNA的表達載體在抗乳腺癌藥物制備中的應用。

本發明的目的通過如下技術方案實現：

發明內容

一種特異性抑制人KCTD1基因表達的siRNA，其堿基序列及其作用部位如下：

正義鏈5’CGU?CCC?AGU?UCA?GCG?AAU?AdTdT?3’

反義鏈5’UAU?UCG?CUG?AAC?UGG?GAC?GdAdG?3’

作用于人KCTD1mRNA的第678-698位。

所述的siRNA，可以通過人工合成，該siRNA在3’有2-6個dT修飾或2-6個U修飾。

所述的siRNA在抗乳腺癌藥物制備中的應用。

本發明以RNA干擾技術為基礎，從GenBank獲得人KCTD1基因的cDNA序列，根據siRNA靶序列選擇的基本原則，針對KCTD1基因設計了21個核苷酸，在siRNA的3‘端添加兩個脫氧核糖核苷酸(dTdT)呈單鏈懸掛結構，以增強此siRNA在體內和體外的穩定性，防止降解。本發明中所使用的siRNA由本發明人自己設計，委托上海吉瑪公司通過化學法合成。

本發明所述的siRNA能高效特異性地抑制KCTD1基因的mRNA和蛋白水平的表達，不對其它BTB蛋白產生沉默作用。而該siRNA也特異性地緩解了KCTD1對轉錄因子AP-2轉錄活性的抑制，同時MTT分析表明KCTD1過表達促進了MDA-MB-453乳腺癌細胞的生長，而KCTD1-siRNA則抑制了乳腺癌細胞的增殖。

本發明以RNA干擾技術為基礎，從GenBank獲得人KCTD1基因的cDNA序列，根據siRNA靶序列選擇的基本原則，針對KCTD1基因設計了21個核苷酸，在siRNA的3‘端添加兩個脫氧核糖核苷酸(dTdT)呈單鏈懸掛結構，以增強此siRNA在體內和體外的穩定性，防止降解。本發明中所使用的siRNA由本發明人自己設計，委托上海吉瑪公司通過化學法合成。

本發明所述的siRNA能高效特異性地抑制KCTD1基因的mRNA和蛋白水平的表達，不對其它BTB蛋白產生沉默作用。而該siRNA也特異性地緩解了KCTD1對轉錄因子AP-2轉錄活性的抑制，同時MTT分析表明KCTD1過表達促進了MDA-MB-453乳腺癌細胞的生長，而KCTD1-siRNA則抑制了乳腺癌細胞的增殖。軟瓊脂克隆形成實驗結果也一致地顯示KCTD1-siRNA加入后乳腺癌細胞形成克隆的數目急劇下降。因此，本發明可能提供一種全新作用機制的抗乳腺癌治療方式和藥物。

本發明的優點：

本發明提供的KCTD1-siRNA可以特異性抑制人KCTD1基因的表達，從而達到抑制乳腺癌的發生和生長的目的。該siRNA可用于制備特異性強的抗乳腺癌藥物。

附圖說明

圖1：RT-PCR檢測KCTD1?siRNA對KCTD1基因的mRNA水平的抑制

圖2：Western?Blotting檢測KCTD1?siRNA對KCTD1蛋白水平的抑制

圖3：Luciferase分析KCTD1?siRNA對AP-2的轉錄活性的影響

圖4：MTT分析KCTD1?siRNA對乳腺癌細胞增殖的影響

圖5：軟瓊脂克隆形成實驗分析KCTD1?siRNA對乳腺癌細胞生長的影響

具體實施方式

實施例1：siRNA靶序列的選擇