[發明專利]一種熒光實時定量PCR檢測香港海鷗型菌的試劑盒及檢測方法

無效

• 申請號: 200910041708.0
• 申請日: 2009-08-06
• 公開（公告）號: CN101619349A
• 公開（公告）日: 2010-01-06
• 發明（設計）人: 李來好;楊賢慶;岑劍偉;郝淑賢;石紅;吳燕燕;魏涯;刁石強;周婉君;陳勝軍;戚勃;馬海霞;黃卉
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院南海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64;C12R1/01
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司
• 代理人: 宣國華

1、一種熒光實時定量PCR檢測香港海鷗型菌的試劑盒，其特征在于，含有以下分離包裝的試劑：

(1)裂解液，內含質量濃度為10％的CTAB溶液，質量濃度4.1％的NaCl溶液和質量濃度0.1～0.5％的SDS；

(2)蛋白酶K，內含1mg/mL蛋白酶K；

(3)抽提液，內含酚、氯仿和異戊醇，所述酚∶氯仿∶異戊醇的體積比為25∶24∶1；

(4)TE緩沖液，內含0.1～0.5mol/LTris-HCl(pH7.0)緩沖液，50mmol/L?EDTA；

(5)熒光PCR反應液，內含1～2Uhot?start?Taq酶、3～5.5mmol/L的Mg²⁺、100～200μmol/L?dNTPs、1×PCR?buffer、1×SYBR?Green?I?solution、100～300nmol/L的上下游引物；

上游引物序列為TACCGCATACGCCCTGAG；

下游引物序列為TTCGCCATTGGTGTTCCT；

(6)ROX染料；

(7)陽性對照液，內含香港海鷗菌總DNA；

(8)陰性對照液，內含無菌水。

2、根據權利要求1所述的熒光實時定量PCR檢測香港海鷗型菌的試劑盒，其特征在于，所述的熒光PCR反應液中1×PCR?buffer含有0.2～0.3mmol/L?KCL、0.01～0.1mmol/L?Tris-HCl和0.01～0.05mmol/L的MgCl₂。

3、根據權利要求1所述的熒光實時定量PCR檢測香港海鷗型菌的試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照液中香港海鷗菌的總DNA含量不低于500ng。

4、一種利用權利要求1所述的熒光實時定量PCR試劑盒檢測香港海鷗型菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

a)樣品預處理取樣品，按樣品與無菌水的重量體積比為0.125～0.5∶1加入無菌水，充分震蕩懸浮，經離心處理后，棄去上清液；

b)在步驟(1)所得沉淀物中加入0.5～1.5mL的裂解液，震蕩使沉淀物徹底懸浮；

c)在步驟(2)所得懸浮液中加入50～100μl的蛋白酶K溶液，混勻，放置5min后，在70℃放置30～50min至溶液變澄清；

d)在步驟(3)所得澄清液中加入等體積的按體積比為25∶24∶1配制的酚、氯仿和異戊醇的混合溶液進行抽提，5000rpm離心10min，得上清液；

e)取步驟(4)所得上清液，加入等體積的異丙醇，振蕩充分混合，室溫下放置10min，12000rpm離心5min，棄去上清液；

f)在步驟(5)所得沉淀物中加入0.5ml70％的乙醇，振蕩30s，12000rpm離心5min，棄去上清液，室溫干燥5min，加入20～50μl?TE緩沖液漩渦振蕩，得樣品PCR模板；

g)熒光PCR反應

依次取熒光PCR反應液，樣品PCR模板，陽性對照液，陰性對照液，0～1μl的ROX內參染料，加入到PCR反應管中，將反應管置于熒光PCR儀上，按下列條件進行擴增反應：94℃3～5min預變性→94℃，30～50s→54℃，50s→72℃，1min20S(檢測熒光值)→第二步至第四步35～40個循環→60℃，15s→以0.1℃/s的速率升溫，直到95℃，整個過程進行連續采集熒光→95℃，15s；

h)結果及判斷

陰性對照：無擴增曲線，Ct值≥40；熔解曲線無單一峰；

陽性對照：出現典型的“S”擴增，Ct值＜19；熔解曲線在85～90℃間有相應的單一峰；

樣品結果：若樣品Ct值≥40，且熔解曲線無單一峰，即可判斷樣品為陰性，可直接報告出未檢測出香港海鷗形菌；若樣品Ct值≤30，且熔解曲線在85～90℃間有相應的單一峰，可判斷樣品為陽性；若樣品Ct值＞30，而＜40，則重做樣品，重做結果若是Ct值≥40，熔解曲線無單一峰，則樣品為陰性，否則為陽性。

5、根據權利要求4所述的利用熒光實時定量PCR試劑盒檢測香港海鷗型菌的方法，其特征在于，步驟a)的樣品預處理的具體過程為：取樣品0.5～2g置于滅菌的Eppendorf管中，加入4ml無菌水，充分震蕩懸浮，4000rpm離心5min，取上清液3.5mL轉入無菌Eppendorf管中，6000rpm離心5min，取上清液3mL到無菌Eppendorf管中12000rpm離心5min，棄去上清液。