[發明專利]一種篩選動物抗病育種的方法和篩選豬抗病育種的遺傳標記

有效

• 申請號: 200910040940.2
• 申請日: 2009-07-07
• 公開（公告）號: CN101654700A
• 公開（公告）日: 2010-02-24
• 發明（設計）人: 蔣雋;柳小春;周紅麗;馬海明;何雋;賀長青;黃生強;劉定發
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學;劉定發;蔣雋
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/12
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司
• 代理人: 陳 衛;曾志洪

技術領域

本發明涉及利用分子生物學技術對動物進行篩選育種的領域，具 體涉及一種篩選動物抗病育種的方法和篩選豬抗病育種的遺傳標記。

背景技術

人和動物體都存在很多的大腸桿菌，但并不會全引起人和動物發 病，是有少數引起人和動物發病，這些能引起人和動物發病的大腸桿 菌正常情況下很少存在于健康體內，這類病原菌根據其毒力因子與發 病機制不同，可分為五類：腸毒素大腸桿菌(ETEC)，類志賀毒素 大腸桿菌(EPEC)，敗血性大腸桿菌(SEPEC)及尿道致病性大腸 桿菌(UPEC)，其中前兩種與動物的疾病關系最密切。

其中，腸毒素大腸桿菌(ETEC)是一種引起人和動物腹瀉最常 見的大腸桿菌，其致病力主要由黏附于性菌毛和腸毒素兩種毒力因子 構成，二者密切相關缺一不可。

黏附素性菌毛是人和動物ETEC的一類特有菌毛，因其能黏附于 宿主的大腸上皮胞，故稱其為粘附素或定居因子抗原。迄今，在動物 ETEC中已發現的黏附素主要有F4(K88)、F5(K99)、F6(987P) 和F41，其次F42和F17。

目前F4受體已從上皮細胞刷狀緣、小腸膜和粘液中提取。它可 能是一種復合糖(Erickson?AK，Wingohs?JA，McFarland?SY，et?al. Indentification?of?two?porcine?brush?border?glycoproteins?that?bind?the F4ac?adhesin?of?Escherichia?coli?and?correlation?of?these?binding glycoproteins?with?the?adhesive?phenotype[J].Infect?Immun，1992，60： 983-988.)，而Grange和Mouricout報道它可能是74kDa的轉鐵蛋白， 以及一種小腸中性鞘糖脂(Grange?PA，Mouricout?MA.Transferrin association?with?the?porcine?intestinal?mucosa?is?a?receptor?specific?for the?F4ab?fimbriae?of?Escherichia?coli[J].Infect?Immun，1996，64： 606-610.)。

粘附素雖然不是導致宿主腹瀉的直接致病因子，但它是構成 ETEC感染的首要因子，ETEC必須首先粘附于宿主的大腸上皮細胞， 才能避免腸蠕動和腸液分泌的清除作用，并在腸內定居和繁殖，進而 發揮致病作用。

這些粘附素要在小腸粘膜附著，還必須在小腸粘膜上皮細胞刷狀 緣有特異性受體，不同動物腸粘膜有無特異性受體是由基因控制的， 無受體的動物在受到細菌感染時不發病，表現為抗性。

目前豚鼠、蠔牛和豬等多種動物都存在ETEC致死現象，尤其是 豬，因此尋找和篩選ETFC受體的遺傳標記是培育出具有抗性動物的 重要途徑。

發明內容

本發明的目的是針對ETEC在動物飼養中導致瀉痢的現象，提供 一種通過分子生物學技術找出ETEC粘附素F4受體的相關基因- PMCA1，并研究該PMCA1基因的多態性，從而能有效地篩選動物 抗病育種的方法。

本發明的另一個目的是提供一種利用上述方法專門用于豬的抗 病育種篩選的遺傳標記。

本發明的另一個目的是提供上述遺傳標記在豬標記輔助選擇中 的應用。

本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的：

鑒于目前ETEC引起動物瀉痢的情況在豬中最為常見，因此本發 明人選擇豬作為研究對象，采用分子生物學的方法篩選ETEC的粘附 素F4受體的相關基因，其步驟如下：

(1)分別采集不同品種初生仔豬的小腸，采用體外黏附測定檢測 各樣品的黏附性；

(2)提取小腸上皮細胞總RNA，并將之反轉錄成cDNA；

(3)利用δ差異顯示引物實施差異PCR，采用聚丙烯酰胺凝膠電 泳和銀染法顯示PCR產物；

(4)將差異帶回收后再PCR擴增，以增加差異DNA數量；

(5)Northern?blot鑒定陽性差異帶；

(6)將陽性差異帶克隆并測序后，將序列進行數據庫同源性分析；

(7)根據測序結果和序列分析結果，篩選與受體有關的基因。