[發明專利]一種產生誘導多能干細胞的細胞類型及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 200910040233.3
• 申請日: 2009-06-15
• 公開（公告）號: CN101671650A
• 公開（公告）日: 2010-03-17
• 發明（設計）人: 裴端卿;米蓋爾·埃斯特班;楊佳銀;秦大江
• 申請（專利權）人: 中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06;C12N5/08;C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司
• 代理人: 劉孟斌

技術領域

本發明涉及細胞領域，特別涉及一種可高效誘導產生誘導多能干細胞(iPS)的誘導重編程方法。?

背景技術

干細胞(stem?cells)是人體及其各種組織細胞的初始來源，其最顯著的生物學特征是既有自我更新和不斷增殖的能力，又有多向分化的潛能。干細胞根據不同的來源分為成體干細胞(somatic?stem?cells)和胚胎干細胞(embryonic?stem?cells，ES細胞)。成體干細胞包括骨髓間充質干細胞、胰腺干細胞、神經干細胞等成體組織中存在的。?

1981年，ES細胞的分離和培養首先在小鼠中獲得成功，是至今研究最廣泛、最成熟的干細胞體系。而人的干細胞的代始于1998年，美國威斯康辛大學(University?of?Wisconsin)科學家湯姆森(James?A.Thomson)帶領研究團隊首次從人類胚胎組織中提取培養出胚胎干細胞(Embryonic?Stem?Cell，ES?Cell)株，并且證實此株細胞具有全能干細胞特征，此項研究論文發表在1998年11月6日出版的頂級學術期刊Science上面。(詳見：Thomson，J.A.，J.Itskovitz-Eldor，S.S.Shapiro，M.A.Waknitz，J.J.Swiergiel，V.S.Marshall，and?J.M.Jones.″Embryonic?stem?cell?lines?derived?from?human?blastocysts.″Science?282(1998)：1145-1147。Thomson等人，從人胚泡中獲取胚胎干細胞系，科學，282(1998)：1145-1147。)這篇論文標志著一個時代的到來，而湯姆森也被人稱作″干細胞研究之父″。?

hES(人胚胎干細胞)細胞研究的應用前景主要是再生醫學領域，在組織工程學領域中以hES細胞作為種子細胞，可為臨床上細胞、組織或器官的移植治療提供大量的材料。通過控制hES細胞分化培養環境、轉染能夠促進ES細胞定向分化的關鍵分子基因等體外誘導分化策略，可獲得特異性的組織細胞類型。這類細胞用于移植治療，將給糖尿病、帕金森氏病、脊髓損傷、白血病、心肌損傷、腎衰竭、肝硬化等疾病的治療帶來新的希望。?

然而，一直以來，hES細胞研究面臨著許多難題和爭議，主要包括以下幾個方面：(1)供體卵母細胞的來源困難，hES細胞建系效率低。此外，SCNT技術的不成熟必將需要進一步耗費更多的人類卵母細胞，故而其來源難以得到保證。(2)免疫排斥反應，除非采用SCNT技術，否則患者對hES細胞分化而來的各種細胞和組織仍然存在免疫排斥反應。(3)hES細胞具有成瘤性，移植到受體的體內后有發展為腫瘤的可能性，即使采用SCNT技術、給移植細胞設置自殺基因等應對措施，也不一定能夠很好地解決這個問題(4)體外保持hES風險。同樣，慢病毒轉染技術可能也存在類似的風險。?

為避開hES細胞和治療性克隆研究的倫理學爭論，需要找到一種替代途徑，以便將人類的體細胞直接轉化為多潛能干細胞，為患者提供“個性化”的自體干細胞。2003年，Gurdon研究小組發現，將已完全分化的小鼠胸腺細胞或成人外周血淋巴細胞的細胞核注入爪蟾卵母細胞后，哺乳動物細胞核的分化標志物喪失，而哺乳動物干細胞中最具特征性的標志物Oct4則呈高表達，提示哺乳動物細胞核可直接被兩棲動物卵母細胞核泡所重構從而表達Oct4(Byrne?JA等人，Nucleiof?adult?mammalian?somatic?cells?are?directly?reprogrammed?to?oct-4?stem?cell?geneexpression?by?amphibian?oocytes.Curr?Biol?2003；13：1206-1213。Byrne?JA等人，成年哺乳動物體細胞核可直接被兩棲動物卵母細胞核泡所重構從而表達Oct4.當代生物學，2003；13：1206-1213)。?

2006年，日本京都大學Yamanaka研究小組采用體外基因轉染技術，從24個因子中篩選出Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4個轉錄因子，通過逆轉錄病毒將上述4個轉錄因子導入胚胎小鼠成纖維細胞或成年小鼠尾部皮膚成纖維細胞，在小鼠ES細胞的培養條件下獲得了Fbx15+的多潛能干細胞系，該細胞系在細胞形態、生長特性、表面標志物、形成畸胎瘤等方面與小鼠ES細胞非常相似，而?在基因表達譜、DNA甲基化方式及形成嵌合體動物方面卻不同于小鼠ES細胞，故將其命名為誘導的多能性干細胞(iPS細胞)。?