[發明專利]腺相關病毒載體及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 200910040168.4
• 申請日: 2009-06-11
• 公開（公告）號: CN101643749A
• 公開（公告）日: 2010-02-10
• 發明（設計）人: 李川源;黃倩;吳沛宏;黃亞森
• 申請（專利權）人: 吳沛宏;黃亞森;李川源;黃倩
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;A61K48/00;A61P31/20;A61P35/00;A61P1/16
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司
• 代理人: 郝傳鑫

技術領域

本發明涉及生物醫學領域，具體涉及一種具有抑制乙型肝炎病毒復制能力和肝癌細胞生長和轉移的腺相關病毒載體及其構建方法和應用。?

背景技術

乙型病毒性肝炎是我國最主要的傳染病，據統計目前乙肝病毒攜帶者約1.5億，占全國總人口的百分之十以上。大量臨床和亞臨床乙肝患者的存在，不僅嚴重損害了人民群眾的身體健康，造成巨大的社會勞動力喪失及社會健康成本增加。同時，許多資料證實，乙肝病毒也是引起原發性肝細胞癌的主要原因之一。而肝細胞癌是預后最差的惡性腫癌之一，目前無有效的治療方法，五年生存率低于5％。?

乙肝疫苗的應用，對未感染乙肝病毒的人群起到了有效的保護作用，但對感染者無治療作用。目前對乙肝患者僅有的治療手段為a干擾素和類核苷物，“Lamivudine”和“Adefovir?dipivoxil”，但臨床效果仍不理想。?

siRNA現象為近年生物學上一革命性的發現，它通過特異性地與靶基因結合，選擇性抑制靶基因表達，從而干擾靶基因的功能。目前的研究證實，siRNA技術可以應用到許多病毒性疾病，如HBV、HCV，HIV等，干擾相關病毒的復制，以及腫瘤性疾病，如肝癌、鼻咽癌、肺癌等，或選擇性殺傷腫瘤細胞，增強機體的免疫能力，達到治療病毒性疾病或腫瘤的目的。?

乙型肝炎病毒為雙鏈DNA病毒，其基因物質相對于突變頻繁的HIV等病毒，十分保守，突變少。乙型肝炎病毒少突變的生物學特性特別適合siRNA治療。各國實驗室對乙肝病毒進行了大量的體外及動物體內siRNA抑制有效性研究，是利用siRNA干擾技術進行人體臨床試驗準備最充足的一個病毒。?

由于siRNA干擾在動物體內實驗的結果令人十分鼓舞，加之目前對病毒性?疾病、腫瘤性疾病缺乏有效的治療措施，siRNA干擾技術被廣泛應用于病毒性疾病及惡性腫瘤的治療方面，因此，僅在美國就有115家商業性公司從事siRNA方面的研究(www.researchandmarkets.com)，在眾多公司中，Sirna、RNAiTechnologies、OligoEngine、Ambion和Stratagen為其中的佼佼者。?

干擾素(interferon)的發現和研究已有五十多年的歷史。干擾素為脊椎動物在外源性抗原的刺激下免疫系統所產生的一組糖蛋白。不同亞型干擾素對外源性抗原如病毒、病菌，內源性的腫瘤細胞有著不同程度的非特異性的殺傷和抑制作用，已被應用于臨床，并被證實是有效的。?

近年來，隨著高效干擾素(RECOMBINANT?SUPER?COMPOUNDINTERFERON，rSIFN-co)的發現和其對病毒、腫瘤細胞的高效殺傷作用，引起醫學界對干擾素抗病毒和抗腫瘤的再認識。?

高效干擾素是根據不同類型干擾素氨基酸順序的保守性，人工產生的一種新的干擾素，有別于普通干擾素，可產生超強的抗病毒及抗腫瘤作用。目前在國內外都有高效干擾素進入臨床試驗階段。但都為利用基因工程技術在大腸桿菌等原核細胞中表達、進而純化的干擾素。?

腺相關病毒(AAV)載體是目前唯一一個被美國食品和藥物管理局(FDA)批準可以用于臨床基因治療的載體，AAV載體最大的特點是：不致病，十分安全；根據血清型的不同，可選擇性感染不同類型的組織或細胞；可以較長時間穩定表達所攜帶的基因；通常情況下重組的AAV以核外染色體形式存在，野生型AAV的整合部位也很清楚，不會誘發被感染的細胞癌變。但是，AAV載體的生產和純化技術復雜，要求很高的技術和經驗，較難推廣。?

因此，需要發明一種新的腺相關病毒載體以解決上述問題。?

發明內容

本發明的目的是提供一種腺相關病毒載體，充分結合shRNA、a干擾素和腺相關病毒載體三方面的優勢，能夠抑制乙型肝炎病毒的復制能力和肝癌細胞生長和轉移。?

本發明還提供了一種腺相關病毒載體的制備方法和應用。?

本發明提供了一種腺相關病毒載體，包括編碼針對乙型肝炎病毒表面抗原siRNA的編碼基因shRNA和人工a干擾素編碼基因。?

作為本發明腺相關病毒載體的優選實施方式，所述的腺相關病毒的載體非選擇性或選擇性在肝組織或肝癌細胞中表達。?

作為本發明腺相關病毒載體的優選實施方式，所述的腺相關病毒的載體包括各種血清型，特別是1型、2型、8型及嵌合型。?