[發明專利]一種人角質細胞生長因子-1結構類似物及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 200910040106.3
• 申請日: 2009-06-09
• 公開（公告）號: CN101575372A
• 公開（公告）日: 2009-11-11
• 發明（設計）人: 蔡祥勝;盛國慶;佘妙琴
• 申請（專利權）人: 中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院
• 主分類號: C07K14/50
• 分類號: C07K14/50;C12N15/63;C12P21/02;A61K38/18;A61K8/64;A61P1/04;A61P17/02;A61P17/16;A61Q19/00
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司
• 代理人: 劉孟斌

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種人角質細胞生長因子-1結構類似物，特別涉及一種人角質細胞生長因子-1結構類似物的及其制備方法和應用。

背景技術

角質細胞生長因子-1(Keratinocyte?Growth?Facfor-1.KGF-1)也叫成纖維細胞生長因子-7(FGF-7)，因為其具有顯著的促進上皮細胞增殖的作用而受到科學家的關注。現已證明，它對多種上皮細胞包括II型肺泡上皮細胞、肝實質細胞、胃腸細胞、尿道上皮細胞和各種鱗狀上皮的角化細胞等都有作用。由于KGF對許多組織的上皮細胞都具有促增殖作用，因此對皮膚、角膜、膀胱、腎、肺、腸、肝等部位上皮組織的損傷具有重要的修復作用。

KGF-1具有刺激胃腸系統的上皮細胞的增殖和分化的功能，對保持胃腸系統牯膜的完整性和促進損傷修復有很重要的作用。研究表明，KGF-1能夠誘導胃上皮細胞的增殖，同時，KGF-1還能降低胃酸的分泌。因此，KGF-1具有治療胃腸系統潰瘍的功能。和傳統的治療藥物相比，KGF-1在起到傳統藥物抑制胃酸作用的同時，還能從根本上促進胃腸系統上皮細胞的增殖和分化，從而使潰瘍面重新上皮化而得到完全的恢復。Farrell等證明，在小鼠的放療和化療模型中，給小鼠預先滴注重組KGF-1，可以降低小鼠的胃腸道損傷，顯著改善小鼠的生存狀態。放療和化療在殺死腫瘤細胞的同時，使胃腸系統的細胞同樣受到損傷，影響患者的生存狀態，在放化療的同時使用KGF可使胃腸系統的細胞存活率增加55％或更多。在化療模型和放化療結合模型中，應用KGF-1能夠加速恢復期的體重增加。其對胃腸粘膜的保護機制是KGF的預處理增加了小腸絨毛的高度和隱窩的深度，同時，KGF-1對小腸隱窩干細胞也有直接作用，加強隱窩細胞在放化療中的存活率。因此，KGF-1在治療胃腸系統的損傷和降低癌癥放化療的毒副作用方面具有十分重要的意義。

已有充分證據表明，KGF-1蛋白分子極不穩定，KGF-1的5個半胱氨酸分別位于1、15、40、102、106位，其中1位與15位以及102位與106位之間分別形成二對二硫鍵，而40位的半胱氨酸以自由的形式存在的，全長的KGF-1由于二硫鍵之間的錯配容易造成蛋白的不穩定和聚集。研究發現，缺失第1位與15位的半胱氨酸，KGF-1的穩定性不但提高，活性也比原來提高了5～10倍。通過對其N端進行改造和對活性位點(第122～133位氨基酸殘基)的點突變則使蛋白活性出現了不同程度的改變。

目前使用哺乳動物細胞表達KGF-1產量極低且造價昂貴，而使用大腸桿菌進行表達雖然具有表達量高和成本較低的特點，但是由于KGF-1本身具有的5個半胱氨酸，造成在表達過程中主要形成包涵體，而且這種包涵體往往難于復性。因此，使用弱啟動子降低其表達的速率，同時使用分子伴侶幫助其正確折疊，從而獲得大量可溶的人KGF-1，有望獲得令人滿意的KGF-1產量。

到目前為止，還沒有報道在將N末端缺失22個氨基酸(即Δ22KGF-1)的基礎上，將第23位氨基酸殘基由精氨酸突變為甘氨酸，第128位氨基酸殘基突變由天冬酰胺突變為非極性氨基酸的報道。

發明內容

為了克服上述技術缺陷，本發明的第一個目的在于，提供一種人角質細胞生長因子的類似物，與人角質細胞生長因子的蛋白質結構相比較，該類似物的蛋白序列的N末端缺失22個氨基酸(即Δ22KGF-1)，將第23位氨基酸殘基由精氨酸突變為甘氨酸，第128位氨基酸殘基突變由天冬酰胺突變為非極性氨基酸，如絲氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，優選為絲氨酸。將此類似物命名為KGF-1/GLYS。

本發明的結構類似物KGF-1/GLYS具有序列4所示的氨基酸序列，其基因具有序列3所示的核苷酸序列。

本發明的第二個目的在于公開KGF-1/GLYS蛋白的制備方法：通過PCR擴增得到含突變位點的人角質細胞生長因子-1的cDNA，將所述cDNA片段與表達載體連接，連接產物轉化感受態細胞，篩選陽性克隆，表達純化。

所述的突變位點包括R23G和N128S。

所述的表達載體具有trp啟動子，并與編碼具有輔助表達折疊功能的TRX蛋白的基因可操作的連接。

該方法是使用本實驗自己構建的ptrpTRX載體表達目的蛋白。該載體具有啟動能力較弱的trp啟動子及幫助折疊的硫氧還蛋白TRX，可以有效地控制蛋白表達的速率和折疊效果。