[發(fā)明專利]用于獲取全肝支架的試劑盒及全肝支架獲取方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910039956.1
• 申請日: 2009-06-03
• 公開（公告）號: CN101564554A
• 公開（公告）日: 2009-10-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 康玉占;汪艷;高毅;周煥城
• 申請（專利權(quán)）人: 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36;A61L27/56
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司
• 代理人: 劉延喜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種獲取生物支架時使用的試劑盒，具體涉及用于獲取全肝支架的試劑盒。本發(fā)明還涉及使用所述試劑盒獲得全肝支架的方法。

背景技術(shù)

當(dāng)前，對終末期肝病(肝硬化，肝性腦病、肝癌)唯一有效的治療方法只有肝臟移植。其他的方法如透析等雖然能延長人的生命，但是不能替代肝臟的所有功能，很難防止病情惡化。肝移植目前雖然在手術(shù)方面已相當(dāng)成熟，但是存在供肝短缺及術(shù)后需要長期應(yīng)用免疫抑制劑等問題，嚴(yán)重限制了肝移植在臨床上的應(yīng)用。因此，通過肝組織工程來緩解供體短缺的現(xiàn)狀具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

肝臟組織工程中理想的支架材料應(yīng)具有以下性質(zhì)：連通的三維多孔結(jié)構(gòu)和足夠的孔隙率，有利于細(xì)胞生長、養(yǎng)分傳輸和代謝產(chǎn)物的排放；生物相容性好，降解性能合適，使得器官能夠生長并逐漸代替支架；化學(xué)表面適合細(xì)胞的粘附、增殖和分化；機(jī)械性能與所植入的組織的要求相匹配；適合細(xì)胞附著的表面式樣和結(jié)構(gòu)；加載促進(jìn)生長和功能形成的表面因子，以及合適的支架表面涂層。目前肝臟組織工程支架材料主要選自可降解高分子材料和天然基質(zhì)材料，例如聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物(PLGA)、海藻酸鈉、殼聚糖、膠原、纖維連接蛋白、層連蛋白、透明質(zhì)酸等以及其經(jīng)過修飾后的材料。但是，現(xiàn)有的支架材料在機(jī)械強(qiáng)度、生物降解、模擬組織三維結(jié)構(gòu)及血管化方面都存在缺陷。

AtalaAnthony等在美國專利申請第US2005/0249816號中公開了一種肝臟去細(xì)胞化的方法。去細(xì)胞化是將組織或器官上的細(xì)胞利用不同的方法洗脫下來，僅保留細(xì)胞外基質(zhì)的技術(shù)。器官通過去細(xì)胞化后所得細(xì)胞外基質(zhì)保留了原器官的內(nèi)部三維支架結(jié)構(gòu)，且具有較好的生物相容性，可作為組織工程支架材料。該方法通過機(jī)械手段和化學(xué)手段來實(shí)現(xiàn)，主要的步驟包括：機(jī)械攪動或震蕩離體肝臟使其內(nèi)的細(xì)胞膜破裂，然后用細(xì)胞裂解液浸泡或灌注肝臟使細(xì)胞分離脫落，最后用灌洗液沖洗肝臟中脫離的細(xì)胞，其中細(xì)胞裂解液可以是含有去污劑的堿性溶液，如含0.5％Triton?X-100的氨溶液，所述的灌洗液可以是蒸餾水、生理鹽水或培養(yǎng)基。該方法過程較復(fù)雜，且單用一種去污劑去細(xì)胞的作用不夠完全。

發(fā)明內(nèi)容

為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種具有良好的機(jī)械強(qiáng)度、生物降解性、模擬組織三維結(jié)構(gòu)及血管化的全肝支架，本發(fā)明一方面提供一種用于獲取全肝支架的試劑盒，其包括灌注液I：0.1％-10％(體積/體積)非離子型去污劑的Tris-HCl溶液；和灌注液II：0.1％-10％(質(zhì)量/體積)離子型去污劑的Tris-HCl溶液。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，所述非離子型去污劑選自Triton?X-100、Tween?20、Tween?40和Tween?80。優(yōu)選地，所述非離子型去污劑為Triton?X-100。

在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，所述離子型去污劑為十二烷基硫酸鈉(SDS)或熊去氧膽酸。

在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，所述灌注液I是通過將非離子型去污劑溶于pH7-8、50-100mM的Tris-HCl中制成的。

在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，所述灌注液II是通過將離子型去污劑溶于pH7-8、50-100mM的Tris-HCl中制成的。

本發(fā)明的另一方面提供一種獲取全肝生物支架的方法，其包括以下步驟：

(a)以權(quán)利要求1所述的灌注液I灌注離體肝臟，使得肝臟由土黃色變成乳白色；

(b)以蒸餾水灌注以充分洗脫灌注液I中的非離子型去污劑；

(c)以權(quán)利要求1所述的灌注液II灌注，使得肝臟變?yōu)橥该鳎?/p>

(d)以蒸餾水灌注以充分洗脫灌注液II中的離子型去污劑。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，優(yōu)選的灌注速度為4～1000ml/min，并且步驟(a)和步驟(c)可同時進(jìn)行，或連續(xù)進(jìn)行。灌注速度的選擇與具體的動物有關(guān)，以灌注速度不實(shí)質(zhì)性地?fù)p傷支架(例如血管部分)為宜，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過有限次簡單的實(shí)驗即可確定對于不同動物的肝臟所能采取的合適灌注速度，或者采取的灌注速度與不同動物的肝臟血流量相當(dāng)，以減少對保留成分的損傷，特別是血管的損傷，例如人的門靜脈血流量為750ml/min，肝動脈血流量為350ml/min，灌注時可以采用相似的速度。

在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，在灌注之前或之中，對離體肝臟進(jìn)行機(jī)械攪拌和/或超聲波處理。

在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，在灌注之前對離體肝臟施用螯合劑。優(yōu)選地，所述螯合劑為乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)。螯合劑結(jié)合Ca²⁺，松解了細(xì)胞之間的橋粒連接，使得洗脫相對容易。