[發明專利]一種用于肝細胞規模化培養的培養液

有效

• 申請號: 200910039868.1
• 申請日: 2009-05-31
• 公開（公告）號: CN101638636A
• 公開（公告）日: 2010-02-03
• 發明（設計）人: 周煥城;蔣澤生;高毅;張志;劉勇
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學珠江醫院
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司
• 代理人: 劉延喜

技術領域

本發明涉及細胞培養用培養液，具體涉及用于肝細胞規模化培養的培養 液。

背景技術

在20世紀80年代，隨著肝細胞分離、培養技術的成熟以及生物醫學工 程等技術的發展，以培養肝細胞為基礎的生物人工肝逐漸發展起來，人們一 直希望采用這種體外肝臟支持的方法來代替患者衰竭的肝功能，為其等待肝 移植或自身肝再生創造條件。目前認為，生物人工肝要達到理想支持效果至 少需要10¹⁰以上數量級的細胞，而在保障細胞活性的條件下，肝細胞數量越 多，其支持及治療效果將越佳，因此，肝細胞體外大規模培養技術已成為生 物人工肝技術發展的核心技術。雖然肝細胞體外大規模培養技術已取得了許 多重大的進展，目前仍難于滿足生物人工肝發展的需要，存在許多問題，例 如：

一、細胞培養環境中抑制因素的積聚是提高細胞密度的主要限制因素。

1、體外動物細胞培養中氨離子的積累是抑制細胞生長的主要因素之一， 對細胞有很大的毒害作用。氨離子主要來源于兩方面：(1)直接來源于培養 基；(2)由細胞代謝產生。氨離子的積聚不僅可抑制谷氨酰胺(Gln)代謝途 徑，使天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)消耗增加，還可使細胞內UDP氨基 己糖(UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺)增加，從而影響肝細胞 的生長及其蛋白的糖基化過程。

2、高乳酸濃度抑制細胞生長。乳酸是細胞糖代謝的產物，高濃度乳酸可 抑制乳酸脫氫酶(LDH)，阻止NADH向NAD的再生及其偶聯丙酮酸/乳酸的 轉換，使NADH的產生增加，進而可部分地抑制糖酵解，減少乳酸的生成。 此外，乳酸抑制糖酵解也可導致丙酮酸濃度降低，從而使Gln的消耗減少。 因此，高濃度乳酸條件下，由于糖酵解和Gln的分解速度降低及能量產生減 少，導致大部分能量用于離子濃度梯度的維持，必將使細胞生長受抑。

氨和乳酸對細胞的毒性作用已在多種不同的細胞系有大量報道，但不同 細胞系對于這兩種代謝產物的耐受性差別很大，可能是由于不同細胞系葡萄 糖和Gln代謝過程中關鍵酶的敏感性不同，或者在不良生長環境下，細胞代 謝途徑特別是氨基酸代謝的改變。

3、甲基乙二醛(MG)對細胞有潛在的損傷作用：MG主要是丙糖磷酸 去除磷酸基后的代謝產物，也是脂類、氨基酸代謝的產物，它能改變氨基酸、 蛋白質和核酸的氨基和巰基，對于細胞有潛在的損傷作用。細胞內MG的水 平是由乙二醛縮酶和還原酶兩種酶的活性來平衡的，經糖酵解途徑進行代謝。

二、氧氣供應相對不足。

氧氣是動物細胞生長的必要物質，且肝細胞更是一種高耗氧量細胞，在 肝細胞大規模培養過程中，消耗大量氧氣，可導致溶氧急劇降低。這種氧的 缺乏也不僅可直接造成細胞的損害，影響細胞的生長速度，還促進培養基中 葡萄糖的無氧酵解，增加乳酸的產生，使得培養基中的PH值急劇下降，又對 肝細胞造成進一步的損害。

三、機械損傷。

肝細胞是錨定依賴性細胞，其功能的有效發揮必須依賴于對支架材料等 支持物的貼附，而在眾多的體外肝細胞規模培養方法中，微載體懸浮培養技 術較其它培養技術具有以下優點：1)表面積/體積比大，單位體積細胞培養基 細胞產率高；2)兼有懸浮培養和貼壁培養的優點；3)培養基利用率高；4) 放大容易，可以達到幾升以上的容積，細胞收獲過程不復雜；5)可用簡單的 顯微鏡即可觀察細胞在微載體表面的生長情況，因而被廣泛應用肝細胞體外 規模化高密度三維培養術中。但是，在細胞培養過程中的許多作用力(如湍 流和氣泡產生的剪切力、微載體間的碰撞)作用下，貼在微載體上生長的細 胞會受到損傷，抑制細胞生長，并導致細胞死亡。

綜上所述，大規模細胞培養過程中，維持細胞高的活力是個富有挑戰性 的課題。最初的研究似乎表明細胞死亡大多由于壞死，而人們逐漸認識到至 少是一些細胞系在生物反應器中細胞死亡主要原因是由于氧氣、營養物質的 缺乏和氨、乳酸等代謝產物蓄積所引起細胞凋亡所致。隨著細胞凋亡分子機 制研究的不斷深入，細胞凋亡的發生被認為是大規模細胞培養過程的重要制 約環節，預防并控制細胞凋亡也因此成為研究熱點。

因此，有必要提供一種肝細胞培養液，其可在同等條件下有效減輕規模 化培養中各種培養環境因素對肝細胞造成的損傷，并抑制肝細胞凋亡的發生， 達到進一步提高肝細胞規模化培養的密度和功能狀態的效果。

發明內容