[發明專利]具有殺狄斯瓦螨活性的幾丁質酶ChiC1及其應用

有效

• 申請號: 200910039643.6
• 申請日: 2009-05-20
• 公開（公告）號: CN101613682A
• 公開（公告）日: 2009-12-30
• 發明（設計）人: 韓日疇;涂爽
• 申請（專利權）人: 廣東省昆蟲研究所
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;A01N63/02;A01P7/02;C12R1/425
• 代理公司: 廣州科粵專利代理有限責任公司
• 代理人: 余炳和

技術領域：

本發明屬于生物技術領域，具體涉及具有殺狄斯瓦螨活性的幾丁質酶ChiC1及其在殺狄斯瓦螨中的應用。?

背景技術：

蜜蜂寄生螨一直是世界養蜂業最主要的危害之一，在全球范圍危害，目前除澳大利亞、非洲部分地區尚未發現蜂螨外，其它洲的蜂群都受到蜂螨的危害。蜜蜂的外寄生螨狄斯瓦螨(俗稱大蜂螨)(Varroa?destructor?Anderson&Trueman)吸食蜜蜂成蜂或幼蟲的體液，造成蜜蜂體質下降，蜂群群勢衰弱；此外，蜂螨還傳播蜜蜂細菌和病毒病害。據報道，最近在美國等國出現的蜜蜂蜂群崩潰失調病(CCD)也與蜂螨的危害有關。每年我國養蜂業僅蜂螨造成的直接損失就達到幾個億人民幣，而且因防治蜂螨使用藥物造成蜂產品污染的間接損失更是不可估量。?

目前主要用于防治蜜蜂螨害的方法有以下3種：(1)物理機械法：如蜂群的熱處理；(2)化學防治法：如使用殺螨劑如有機酸和香精等；(3)生物技術防治法：包括蜜蜂飼養管理技術。但是目前使用最廣泛的主要還是用藥物來防治大蜂螨，其中使用最為普遍的是一種以擬除蟲菊酯類農藥-氟胺氰菊酯為主要原料的殺螨劑“螨撲”(Apistan)。不可否認，藥物治螨起了一定的積極作用。但是，連續和大范圍使用導致的污染和抗藥性問題越來越嚴重。顯然單靠藥物治螨是不夠的，還必須尋找其它途徑來防治蜂螨。?

一些生物防治技術已應用于防治蜂螨，如(1)割除雄蜂房法：自從西方蜜蜂身體上發現蜂螨，也發現蜜蜂對于蜂螨有清除行為，并可減輕蜂螨對蜂群所造成的危害。與此同時，養蜂工作者在實踐中發現，割除雄蜂房也能降低蜂群中蜂螨的寄生密度，減弱蜂螨對蜂群所造成的危害。(2)使用抗螨除蟲多功能巢礎：利用蜂螨繁殖于封蓋房，寄生于蜂體上這一生物學特性，直接把殺螨藥物藏于蜂房中，阻斷蜂螨幼蟲在雄蜂房中正常羽化成成螨，從而達到殺滅蜂螨這一目的。(3)人工選育抗螨新品種：中華蜜蜂對于大蜂螨具有一定的抗性，蜂群內雖曾發現蜂螨，但未給蜂群造成危害。而且西方蜜蜂對于蜂螨也有一定的清理形為，養蜂工作者可以在蜂群中選擇對蜂螨有較強清理行為的蜜蜂為種群，定向培育抗螨性強的蜂群，包括蜜蜂營養雜交(又稱為蜜蜂無性雜交)。(4)利用病原真菌：綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)和Hirsutella?thompsonii對大蜂螨具有一定的防治效果。?

但是，這些措施對蜂螨的控制效果并不令人滿意，如割除雄蜂房法很難徹底消除螨害；?由于長期以來自養自繁的養蜂模式導致的蜜蜂嚴重混雜退化和近親繁殖衰退現象，培育抗螨品系的穩定性也不盡人意；病原真菌的應用仍受制于更有效品系的篩選、蜂巢溫濕度、貯存方法和施用技術。因此，養蜂界仍在嚴重依賴業已產生抗性和引起殘留的化學農藥防治蜜蜂害螨。抗生素和化學農藥的濫用，已經對我們的食品安全和國際貿易造成巨大的威脅。因此，養蜂業急需安全防治蜂螨的替代防治方法，熱切期待環境友好的蜜蜂螨害防治新技術。?

幾丁質酶能夠催化水解幾丁質，產生幾丁寡糖或幾丁二糖。在自然界中很多微生物可以產生幾丁質酶。幾丁質酶具有廣泛的生理功能，在生物防治方面得到了普遍應用；幾丁質酶對殺蟲劑具有增效作用，可加速害蟲的致病過程；幾丁質酶還可抑制病原真菌的生長。但是，到目前為止，未發現利用幾丁質酶控制蜜蜂狄斯瓦螨的報道。?

發明內容：

本發明提供了一種具有殺狄斯瓦螨活性的幾丁質酶ChiC1及其在殺狄斯瓦螨中的應用。?

本發明通過以下技術方案實施的：?

本發明從沙雷氏菌GEI?Serratia?marcescens?GEI的基因組DNA中克隆出一段基因堿基序列，應用原核表達載體pET-32a(+)，在大腸桿菌中表達該基因，對該基因的編碼蛋白進行純化、復性、生物測定表明，該基因的編碼蛋白對狄斯瓦螨具有比較強的毒性，該編碼蛋白的酶活力為14.7U/mL的條件下，沾染該蛋白的狄斯瓦螨，5天后死亡率為25％。經過測序分析表明，該基因的開放讀碼框含有1443個堿基，序列如SEQ?ID?NO.1所示，BLAST分析表明該基因與登錄號為AB019238.1的粘質沙雷氏菌幾丁質酶基因chiC1的相似性為95％，由此認為該基因屬于幾丁質酶chiC1基因類別，是一個幾丁質酶chiC1基因的新序列。?

本發明所述的幾丁質酶ChiC1，由于具有殺狄斯瓦螨的活性，可以作為一種制劑使用，或者將該幾丁質酶基因轉入對環境無害的工程菌中，或者轉入蜜蜂中，來防治蜜蜂的螨害。?