[發明專利]一種赤點石斑魚神經壞死病毒檢測用引物組、檢測方法和快速診斷試劑盒

有效

• 申請號: 200910039534.4
• 申請日: 2009-08-06
• 公開（公告）號: CN101591714A
• 公開（公告）日: 2009-12-02
• 發明（設計）人: 郭志勛;許海東;區又君;馮娟;蘇友祿
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院南海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/78;C12R1/93
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司
• 代理人: 陳 衛

技術領域

本發明涉及水生生物病害的生物學鑒定，尤其涉及魚類病毒性神經壞死病 的檢測，具體涉及一種赤點石斑魚神經壞死病毒檢測用引物組、檢測方法和快 速診斷試劑盒。

背景技術

魚類病毒性神經壞死病又稱病毒性腦病和視網膜病，是世界范圍內的一種 魚類流行性傳染病。病原是魚類神經壞死病毒，屬于野田村病毒科II型野田村 病毒屬。魚類神經壞死病毒分為4種基因型：分別為紅鰭東方鲀神經壞死病毒 (tiger?puffer?NNV，TPNNV)、黃帶鲹神經壞死病毒(striped?jack?NNV， SJNNV)、條斑星鰈神經壞死病毒(barfin?flouder?NNV，BFNNV)和赤點石 斑魚神經壞死病毒(red-spotted?grouper?NNV，RGNNV)。

在中國發現的魚類病毒性神經壞死癥的病原主要是赤點石斑魚神經壞死 病毒。魚類神經壞死病毒對仔魚和幼魚危害很大，感染后死亡率極高，各種魚 類感染NNV后的發病時間及死亡率各不相同，最早發病時間是孵化后1d，一 般是孵化后1-3周開始發病，嚴重者在一周內死亡率可達100％。受NNV感染的 魚包括鰻鱺目、鱈形目、鱸形目、鰈形目和鲀形目5個目17科的40多種魚類。 到目前為止，對于病毒性神經壞死病還沒有有效的治療方法，防止病毒的傳染 和流行是能夠采取的主要措施，早期快速診斷神經壞死病毒是減少損失的有效 途徑，因此，簡便快速、特異性好、靈敏度高的診斷試劑盒及其檢測方法對于 疾病的預防意義重大。

目前常用的檢測技術是以聚合酶鏈式反應(PCR)技術為代表的病原核酸 檢測技術，但是這些檢測技術在實際應用中存在一些問題，如普通聚合酶鏈式 反應(PCR)技術需要專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程煩瑣的 缺點；熒光實時定量聚合酶鏈式反應技術雖然較好地解決了交叉污染的問題， 并簡化了操作過程，但卻需要更復雜的定量測定儀器，不適用于現場快速檢測， 而且實時定量聚合酶鏈式反應PCR技術中熒光探針的成本較高，加大了推廣應 用的難度；免疫學檢測技術快速簡便成本低廉，但要求高質量高穩定性的單克 隆抗體，否則因準確性不夠，目前只能是輔助檢測手段。所以及時運用生物技 術發展的最新成果對滿足病原微生物檢測要求的不斷提高具有重要意義。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated?isothermal?amplification，簡稱LAMP 技術)，是近年來新出現的一種體外擴增特異DNA片段的技術，具有快速、 敏感、特異性強等特點，LAMP主要是利用4種不同的特異性引物(引物F3、 引物B3、引物FIP和引物BIP)識別靶基因的6個特定區段，在聚合酶和等 溫條件下高效、快速、高特異地擴增靶序列，擴增反應結束后，通常是采用染 色劑對反應產物進行分析。LAMP中所用到的聚合酶通常都選用具有鏈置換特 性的DNA聚合酶，如Bst?DNA聚合酶。對LAMP來說，4種特異性引物的 設計是其關鍵所在。

LAMP因其自身的優點，現已被用于病原微生物的檢測和傳染性疾病的診 斷，如：嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)的檢測、分支桿菌屬檢 測、腺病毒性結膜炎檢測、真菌檢測等，現尚未見有將LAMP用于赤點石斑 魚神經壞死病毒檢測的相關報道。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種對赤點石斑魚神經壞死 病毒具有高特異性，可用于環介導等溫擴增技術檢測赤點石斑魚神經壞死病毒 的引物組。

本發明的另一個目的在于提供一種用上述引物組對赤點石斑魚神經壞死 病毒進行快速、高效、高特異性檢測的方法。

本發明的另一個目的在于提供含有上述引物組的快速診斷試劑盒。

本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的：

一、本發明的赤點石斑魚神經壞死病毒檢測用引物組，是基于環介導等溫 擴增技術，根據已公開的赤點石斑魚神經壞死病毒基因組序列，選取赤點石斑 魚神經壞死病毒基因的特異性序列，然后分析設計出的，能專一性鑒別赤點石 斑魚神經壞死病毒的特異性引物組，通過PCR來鑒定赤點石斑魚神經壞死病 毒基因，該引物組由如下四條引物組成：

內引物FIP，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；

內引物BIP，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示；

外引物F3，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示；

外引物B3，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4所示。