[發(fā)明專利]一種人染色體P16基因探針的制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910039411.0
• 申請(qǐng)日: 2009-05-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101886104A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-11-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李明;何瑰;陳娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司
• 主分類號(hào): C12P19/34
• 分類號(hào): C12P19/34;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種人染色體P16基因探針的制備方法，其特征在于制備步驟包括：

(1)克隆篩選：P16基因位于人染色體9p21區(qū)段，挑選包含有該基因的克隆；

(2)克隆培養(yǎng)和鑒定：購(gòu)買(mǎi)克隆，取適量克隆菌液添加到500ml的TB培養(yǎng)液(氯霉素抗性)中，37℃搖床中搖菌培養(yǎng)24～48小時(shí)；使用STS引物對(duì)進(jìn)行克隆鑒定；

(3)P16基因探針制備：對(duì)鑒定陽(yáng)性的菌液，進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取；通過(guò)適當(dāng)稀釋質(zhì)粒DNA，對(duì)質(zhì)粒DNA定量；然后，通過(guò)缺口平移方法對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記；對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行乙醇沉淀和濃縮；獲得P16探針，避光、-20℃儲(chǔ)存；

(4)P16基因探針驗(yàn)證：使用人類正常分裂中期淋巴細(xì)胞滴片進(jìn)行探針驗(yàn)證。

2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于克隆篩選步驟中挑選的克隆號(hào)為：RP11-149I2。

3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于克隆培養(yǎng)和鑒定步驟中使用的STS引物序列分別為上游引物5’-ATCCAACATGCCATAGCTCC-3’和下游引物5’-TTTGTCCCATGTCACTGGAA-3。

4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于克隆培養(yǎng)和鑒定步驟中PCR擴(kuò)增條件均為：95℃5分鐘；(94℃30秒，55℃30秒，72℃45秒)×40循環(huán)；72℃10分鐘。

5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征還在于P16基因探針標(biāo)記的熒光素為熒光素標(biāo)記的dUTP。

6.一種P16基因探針檢測(cè)試劑盒，包括：1)雜交液、DAPI復(fù)染劑，和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中雜交液由雜交緩沖液、熒光標(biāo)記的P16基因探針和H₂O配制而成，其特征在于每人份雜交液中使用P16基因探針的量為1.5ul～3ul，雜交緩沖液為7ul。

7.根據(jù)權(quán)利要求6的試劑盒，其特征還在于雜交緩沖液中去離子甲酰胺濃度為50％～70％。