[發明專利]檢測脆性X綜合征的試劑盒

有效

• 申請號: 200910038862.2
• 申請日: 2009-04-22
• 公開（公告）號: CN101871001A
• 公開（公告）日: 2010-10-27
• 發明（設計）人: 李明;陳嘉昌;陳華云
• 申請（專利權）人: 中山大學達安基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及檢測臨床樣品中脆性X綜合征的試劑盒，特別是涉及以亞硫酸氫鹽修飾-長片段聚合酶鏈反應技術篩查脆性X綜合征的試劑盒。

背景技術

脆性X綜合征(FraX)是一種常見的遺傳性智力低下綜合征，其發病率僅次于唐氏綜合征，呈X連鎖遺傳，占X連鎖智力低下的40％。發病率男性為1/4000，女性為1/6000。外顯率也因性別不同有差異，男性80％，女性30％。脆性X綜合征在表型方面具有兩大特點：一是輕度到重度不等的智力低下，IQ值在20-60之間，伴有不同程度的體型異常；頭大、方額、大耳朵、大下頜，大多數男性患者在青春期發育后出現大睪丸，并有明確的伴性遺傳的智力低下家族史。二是行為障礙，多數男性患者性情孤僻、反應過度和精神失常。許多患者還出現輕度的結締組織異常，如脊柱后側凸、皮膚松弛、關節伸張過渡和二尖瓣脫垂等。當女性患者具有同樣的表型異常時，根據正常基因所在染色體隨機失活的程度而出現不等的外顯率。

95％以上的FraX患者，其發病的分子遺傳學基礎是脆性X綜合征智力低下基因1(FMR-1基因)(CGG)n結構擴展突變，5％以下則是由FMR1基因的錯義突變和缺失型突變影響了FMR1基因的正常結構、功能所導致。

FMR-1基因位于Xq27.3，含17個外顯子，全長38kb。在基因的5’非翻譯區存在一段數目可變的(CGG)n重復序列，其上游250bp處存在一CpG島。CpG島及(CGG)n如發生甲基化，則FMR-1基因的轉錄受到抑制。正常人群FMR-1基因(CGG)n重復次數在6～50之間。前突變(CGG)n重復數在50～200之間且CpG島無異常甲基化，此時FMR-1基因表達基本正常。(CGG)n重復數超過200時為全突變，常伴有CpG島異常甲基化，使FMR-1mRNA的翻譯受抑制，從而造成臨床癥狀。

后續的研究發現前突變的個體可能會患有輕微的認識/行為缺陷，20％的女性攜帶者有卵巢功能早期衰退，40％的男性攜帶者在50歲后會有脆性X綜合征相關的振顫共濟失調癥(FXTAS)。

攜帶前突變的男性能將突變基因傳給女兒，在此傳遞過程中，CGG序列一般不會有大的擴增，不會導致全突變。但是，第三代患病風險則有40％，第四代患病風險已高達50％；而他們的兄弟姐妹患病風險率卻較低(＜9％)，此現象稱為Sherman現象。

全突變母親每次妊娠有50％機會傳遞全突變給胎兒，后者若為男性則幾乎都有智力低下及不育，若為女性則精神發育遲緩(MR)的機會約50％。若母親為前突變攜帶者，則胎兒受累(擴展為全突變)機會與母親CGG重復數大小有關。CGG重復序列越長，出生全突變患兒的可能性越大。當母親的CGG重復數為50-59時，基本后代DNA的CGG不擴展；當母親的CGG重復數為60-69時，后代有17％的幾率產生擴展；當母親的CGG重復數位90-113時，擴展幾率為100％。。前突變和全突變者的親屬出生患兒的可能性也比正常人群高。

脆性X綜合征的常規實驗室診斷主要為染色體分析和分子遺傳學診斷。染色體分析通過誘導X染色體產生脆性部位；但敏感性低，有全突變的男性約15％～50％的細胞有脆性部位，女性僅為0～30％。因此對發病男性的診斷較成功，但前突變的女性和傳遞致病基因的男性容易漏診，因為有脆性部位的細胞百分比低，甚至一些女性和有全突變而表現較輕的男性也不被發現。分子遺傳學診斷主要檢測FMR1基因CGG重復擴展及甲基化狀況。目前有兩種方法：多聚酶鏈反應(PCR)和Southern印跡。PCR對正常范圍的重復序列和較小重復序列的前突變有很高的敏感性，但不能擴增出全突變和較大重復序列的前突變，因此PCR對全突變只能進行間接診斷。一般情況下，當PCR在男性擴增出1個正常范圍或前突變片段，在女性擴增出2個片段(正常范圍，中間范圍或前突變)，不再需要Southern印跡進一步證實。但有時復雜的細胞嵌合體患者PCR方法會產生假陰性。也有學者設計出甲基化敏感PCR來了解男性患者的FMR1基因甲基化情況。但因正常女性存在X染色體失活(甲基化)，該方法并不適用。Southern印跡可以檢測出各種大小CGG重復擴展和甲基化情況，但分辨度低，方法復雜、費時而昂貴，不適于大規模篩查。