[發明專利]花生球蛋白Ara3基因啟動子在驅動外源基因在轉基因植物種子中特異表達上的應用

無效

• 申請號: 200910038619.0
• 申請日: 2009-04-14
• 公開（公告）號: CN101538584A
• 公開（公告）日: 2009-09-23
• 發明（設計）人: 黎茵;鐘玉娟;黃上志;林曉東
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/70;C12N15/74;C12N1/21;C12N5/10;A01H5/00;C12R1/01;C12R1/19
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 陳 衛

技術領域

本發明涉及植物基因啟動子，特別是涉及花生球蛋白Ara?3基因啟動子在驅動外源基因在轉基因植物種子中特異表達上的應用。

背景技術

啟動子(Promoter)是RNA聚合酶能夠識別并與之結合從而起始基因轉錄的DNA序列，是重要的順式作用元件，位于結構基因5`端上游區的DNA序列，能指導全酶與模板的正確結合，活化RNA聚合酶，并使之具有起始特異性轉錄的形式，決定轉錄的方向和效率以及所使用的RNA聚合酶類型，是轉錄調控的中心。

目前，植物基因工程中常用的啟動子為組成型表達啟動子(Constitutivepromoter)，研究發現在組成型啟動子的控制下外源基因的表達存在一些缺陷，而種子特異性啟動子具有顯著的組織和發育時期的特異性，可以控制外源基因在植物種子中高效表達，避免外源基因在植物的其他部位表達，也可避免外源基因在轉基因訴諸植株中非特異表達所造成的能量負荷和物質浪費，減少對植物的不利影響，同時還發揮了植物種子作為蛋白高效表達和貯存器官的優勢。因此，利用種子特異性啟動子控制外源基因在種子中特異表達具有重要的理論和實踐意義。

種子特異性啟動子區別于其它類型啟動子的一個顯著特點是在該類啟動子上游存在一些特異的調控元件，這些調控元件與調控種子特異性基因的特異表達有關，如RY基序、GCN4基序、E盒、G盒、CAAT盒和B盒等。

隨著植物基因工程的發展，一些種子特異性啟動子被克隆，成為轉基因技術中的有利工具，這些種子特異性啟動子有的是貯藏蛋白來源的種子特異性啟動子，如油菜1.7S蛋白基因啟動子、谷蛋白基因啟動子、豆球蛋白基因啟動子、油體蛋白基因啟動子、云扁豆蛋白基因啟動子、2S清蛋白基因啟動子和伴大豆球蛋白基因啟動子等，有的是非貯藏蛋白來源的種子特異性啟動子，如USP基因啟動子、棉花酰基載體蛋白硫酯酶基因啟動子等。這些啟動子都能驅使GUS報告基因或外源基因在植物種子中特異和高效表達。

種子貯藏蛋白是包括人類在內的動物界食用蛋白的第一來源，據估計，人類有50％的食物蛋白直接來源于谷類種子。在種子發育過程中，貯藏蛋白基因是少數幾個在種子中大量表達的基因；種子貯藏蛋白是基因表達的直接產物，大量積累于種子中；種子發育的生理學和遺傳學研究比較深入，這些有利因素使種子貯藏蛋白基因成為研究基因調控的理想對象，因此，從種子貯藏蛋白基因中克隆種子特異性啟動子是十分有效而簡便的方法，并且具有巨大的潛在市場價值和應用價值。

發明內容

本發明的目的是基于種子特異性啟動子在作物改良、生產外源蛋白等應用中的特殊價值，提供花生球蛋白Ara?3基因啟動子在驅動外源基因在轉基因植物種子中特異表達上的應用。

本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的：

花生球蛋白基因Ara?3是貯藏蛋白基因，其GenBank登錄號為DQ519079。本發明人通過對該基因進行研究發現，花生球蛋白基因Ara?3上游從第1位～第634位共長634bp的啟動子序列具有指導基因在植物種子中表達的能力，可驅使外源基因在種子和萌發幼胚組織中特異表達，同時對該序列的結構進行分析，發現第536位～第601位和第36位～第47位為TATA框，第647位～第644位、第641位～第646位、第82位～第86位、第156位～第160位和第124位～第127位的區段上有CAAT框，除此之外，該634bp序列上還包含2個E盒、1個RY基序、1個legumin盒和1個G盒，其中RY基序和legumin盒對于啟動子的種子特異性具有決定意義(Fujiwara?et?al.，Plant?Mol?Biol，24：261-272，1990；Baumlein?et?al.，Plant?J，2：233-239，1992；Rerie?et?al.，Plant?Cell?BiochemBiotech，1：53-104，1992)，G盒也存在于多種種子特異啟動子中(Williams?et?al.，Plant?Cell，.4：485-496，1992)。

本發明的花生球蛋白Ara?3基因啟動子序列可作為啟動子元件，與其它任何一種外源基因連接，插入植物雙元表達載體中，構建重組表達載體。

上述外源基因可以為任意目的基因序列，如同源植物、外源植物、真菌、藻類、細菌、病毒、動物或人類基因，也可以是人工設計合成的DNA序列，這些序列可以是一段編碼有功能的蛋白質或其一部分的正義序列或一段反義序列。