[發明專利]基因AtPAP15在提高大豆植株有機磷吸收利用方面的應用

有效

• 申請號: 200910036465.1
• 申請日: 2009-01-06
• 公開（公告）號: CN101475960A
• 公開（公告）日: 2009-07-08
• 發明（設計）人: 王秀榮;廖紅;嚴小龍
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 林麗明;任 重

1.基因AtPAP15在提高大豆植株有機磷吸收利用方面的應用， 其特征在于是在大豆中超量表達編碼紫色酸性磷酸酶的基因AtPAP15 實現；所述AtPAP15基因編號為Locus：At3g07130，全長cDNA為 1676bp，編碼532個氨基酸，包括6個外顯子和5個內含子。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征是所述超量表達是通過 PCR方法，以AtPAP15的基因組片段作為應用基因，設計引物，擴增 出AtPAP15基因的全長編碼區，并加入來自胡蘿卜的信號肽，由強啟 動子35S驅動，連接到超量表達載體pTF101.1上，進行遺傳轉化。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征是所述引物為： 左端引物(5′-3′)：

ATGACGTTTCTACTACTTCTAC；

右端引物(5′-3′)：

TTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCAATGGTTAACAAGGCGGT。

4.根據權利要求2所述的應用，其特征是遺傳轉化包括以下步 驟：

(1)種子消毒和種子萌發；

(2)根癌農桿菌EHA101菌液制備；

(3)外植體制備及轉化程序；

(4)侵染與共培養；

(5)幼芽的誘導和伸長；

(6)幼芽生根，得到轉基因單株T₀代植株。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征是步驟(1)所述種子消 毒包括以下步驟：

(1)將大豆種子單層排列在培養皿中，培養皿置于干燥器內， 打開培養皿蓋子，干燥器內同時放置一個燒杯，向燒杯中加入次氯酸 鈉溶液，并緩緩加入HCl溶液，蓋上干燥器蓋子，靜置過夜；

(2)蓋上培養皿蓋子并將培養皿放到層流凈化罩中后將培養 皿打開，除去過多的氯氣。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征是步驟(1)所述HCl溶 液濃度為12N，加入量按照次氯酸鈉與HCl溶液的體積比為100mL： 4.2mL。

7.根據權利要求5所述的應用，其特征是步驟(1)所述靜置 過夜時間為13.5小時。

8.根據權利要求4所述的應用，其特征是步驟(5)所述幼芽誘 導和伸長包括以下步驟：

(1)外植體共培養后，用加有篩選劑和抑菌劑的液體幼芽誘導 培養基浸洗；將外植體放在固體培養基上；14天后，在形成中的節的 部位齊平地切去子葉下胚軸；將新鮮的切口表面插入新的固體培養基 中，在培養箱中繼續誘導14天；

(2)將分化的外植體轉移到新鮮的幼芽伸長培養基，所述培養 基加有篩選劑和抑菌劑；每隔2周換一次新鮮的培養基。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于所述抑菌劑為100mg/L 特美汀和200mg/L頭孢霉素的混合物，所述篩選劑為草銨膦。