[發明專利]一種基于金納米棒端面自組裝檢測微囊藻毒素-LR的方法

無效

• 申請號: 200910035793.X
• 申請日: 2009-10-16
• 公開（公告）號: CN101699288A
• 公開（公告）日: 2010-04-28
• 發明（設計）人: 胥傳來;徐麗廣;陳偉;朱穎越;劉麗強;徐乃豐;馬偉;許定華
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/531;G01N15/02;C07K16/14
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一種基于金納米棒端面自組裝檢測微囊藻毒素-LR(MC-LR)的方法，屬于免 疫分析化學技術領域。

背景技術

隨著經濟的發展，含有大量的氮、磷營養物質的污水進入湖泊、水庫使水 體富營養化，致使藻類異常增殖，釋放次級代謝物藻毒素(Algae?Toxins)，威脅 人類的飲用水的安全和水體中其它生物的安全。其中微囊藻毒素(Microcystins， MCs)分布最廣、危害最大，其結構如下：

其含有五個固定成分的氨基酸，兩個可變的氨基酸X、Y。即在上述的結構式中 其中X和Y分別為Leu和Arg的即為MC-LR。MC-LR是最為常見且毒性又最大的一 種微囊藻毒素，世界衛生組織(WHO)推薦的飲用水中的MC-LR的最大殘留限量 為1.0μg/L，我國現頒布執行的生活飲用水水質衛生規范(2001，0.001mg/L)和地 表水環境質量標準(GB3838-2002，微囊藻毒素-LR，0.001mg/L)，因此急需建立 針對MC-LR檢測的一種快速、簡單、靈敏、省力的檢測方法。

常用的檢測藻毒素的方法主要有儀器分析方法、生物化學法及免疫檢測法 等幾大類。儀器分析方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)、質譜、液質聯用等， 這些方法雖然靈敏但其需要昂貴的儀器設備，專業的操作人員，對檢材的要求 也比較高，并且需要進一步的樣本前處理才能進行，這已經不能達到現代檢測 對快速、方便、準確的要求。生物化學法主要是蛋白磷酸酶抑制試驗法，優點 是快速，數小時即可實現對大量樣品的檢測，但其最大的不足之處在于特異性 蛋白磷酸酶等沒有商品供應、特異性差。免疫分析化學方法具有快速，靈敏度 高，操作簡單，專一性好等優點。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于金納米棒端面自組裝檢測微囊藻毒素 (MC-LR)的方法，靈敏度高，操作方便，線性范圍寬。

本發明的技術方案：一種基于金納米棒端面自組裝檢測微囊藻毒素-LR的方 法，包括包被原的修飾，抗體的修飾，修飾的包被原和金納米棒的偶聯，修飾 的抗體和金納米棒的偶聯，反應條件的優化，抑制曲線的測定，實際樣本檢測；

(1)包被原的修飾：

將微囊藻毒素-LR包被原與硫辛酸相偶聯得到修飾的包被原；

(2)抗體的修飾：

將抗微囊藻毒素-LR抗體與硫辛酸相偶聯得到修飾的抗微囊藻毒素-LR抗 體；

(3)用步驟(1)得到的修飾的包被原與金納米棒的端面偶聯得到金納米棒-包 被原探針；

(4)用步驟(2)得到的修飾的抗微囊藻毒素-LR抗體與金納米棒的端面偶聯 得到金納米棒-抗體探針；

(5)對抑制反應的各個條件進行優化；

(6)標準曲線的建立：利用間接競爭免疫檢測原理，將微囊藻毒素-LR和(3) 金納米棒-包被原探針同時加入到一個離心管中，而后向離心管中加入(4)金納 米棒-抗體探針，混勻，通過微囊藻毒素-LR和金納米棒-包被原探針與金納米棒- 抗體探針進行競爭偶聯，通過微囊藻毒素-LR濃度的不同會使形成的粒子形成不 同的粒徑分布，通過納米粒度儀檢測粒徑的變化從而檢測微囊藻毒素-LR的濃 度，建立粒徑-微囊藻毒素-LR濃度的標準曲線。

(7)檢測樣品中微囊藻毒素-LR的濃度。

包被原的修飾：

①0.3mL的含硫辛酸的乙醇溶液，含硫辛酸1.625mg，與0.2mL的微囊藻 毒素-LR包被原溶液混合；

②將75μL的碳二亞胺在磁力攪拌的條件下逐滴滴入步驟①所述溶液中后 室溫反應4h；

③用pH?7.4的磷酸鹽緩沖液透析3天，每天換液3次；

④將修飾后的包被原放在4℃備用。

抗體的修飾：

①0.3mL的含硫辛酸的乙醇溶液，含硫辛酸1.625mg，與0.4mL抗微囊藻 毒素-LR抗體混合；

②將75μL的碳二亞胺在磁力攪拌的條件下逐滴滴入步驟①所述溶液中后 室溫反應4h；

③用pH?7.4的磷酸鹽緩沖液透析3天，每天換3次透析液；

④將修飾后的抗體放在4℃備用。