[發明專利]一種添加海藻糖強化2-酮基-L-古龍酸生產強度的方法

無效

• 申請號: 200910034773.0
• 申請日: 2009-09-09
• 公開（公告）號: CN101654695A
• 公開（公告）日: 2010-02-24
• 發明（設計）人: 劉立明;陳克杰;周景文;陳堅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P39/00
• 分類號: C12P39/00;C12P7/60;C12R1/11;C12R1/01
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一種添加海藻糖強化2-酮基-L-古龍酸生產強度的方法，屬于發酵制備維生素C技術領域。

背景技術

維生素C(即L-抗壞血酸)是人體必需的一種維生素，生理作用廣泛，在醫藥、食品工業上均有重要用途，在整個維生素類藥物生產中占有十分重要的地位。目前我國維生素C生產主要采用“二步發酵法”。該工藝的主要特點在于第二步發酵，即從L-山梨糖到2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)的轉化需要由酮古龍酸菌(Ketogulonigenium?vulgare，通稱“小菌”)與巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium，通稱“大菌”)搭配而成的組合菌系進行混合發酵。

雖然“二步發酵法”以微生物發酵代替了化學合成法，簡化了工藝，減少了污染，降低了成本，但現在仍未完全發揮其潛在的生產能力。比如，工業發酵過程中的補糖以及為維持pH穩定所采取的補堿措施都會引起培養體系滲透壓的上升，從而抑制組合菌系的產酸能力。因此，提高菌株對高滲的耐受能力，從而加強2-KLG的生產強度是非常有必要的。

海藻糖是一種獨特的非還原性二糖，能夠作為相容性溶質使受滲透脅迫的細胞保持穩定。此外，在其它環境脅迫下，如熱脅迫、脫水、缺氧等，也常常涉及海藻糖的積累來提高細胞的生存能力。因此，海藻糖是一種優良的脅迫保護劑。目前，添加海藻糖提高混合菌系對高滲的耐受能力，從而加強2-KLG的生產強度尚未見文獻報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種添加海藻糖作為滲透保護劑，促進酮古龍酸菌(Ketogulonigenium?vulgare)與巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)混合菌系細胞生長和2-KLG生產，加強2-KLG生產強度，縮短發酵周期的方法。

1、菌株

酮古龍酸菌(Ketogulonigenium?vulgare)DSM?4025及巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)ATCC?21916，由江蘇江山制藥有限公司(江蘇靖江)提供。

2、培養基和培養方法

種子培養基(g·L^-1)：L-山梨糖20，酵母膏3，牛肉膏3，大豆蛋白胨10，玉米漿1.5，尿素1，KH₂PO₄?1，MgSO₄?2，CaCO₃?1。

發酵培養基(g·L^-1)：L-山梨糖80，玉米漿5，尿素12，KH₂PO₄?1，MgSO₄?1，CaCO₃?5。NaCl作為滲透壓調節劑，根據要求適量添加。滲透保護劑海藻糖添加濃度為10mmol·L^-1。

所有培養基由自來水配置并用2mol·L^-1NaOH調節pH為6.7～7.0。L-山梨糖和氮源分開滅菌，滅菌條件為121℃，15min。

3、大菌與小菌混合菌系的培養

用接種環挑取新鮮平板上小菌單菌落兩環，再挑取大菌單菌落一環，于無菌水中制成混菌懸液，取混菌懸液涂斜面，30℃培養48h；取斜面混合菌0.4mL接種于種子培養液75mL/750mL搖瓶中。30℃，200rpm下培養18h，即制成大小菌混合菌系，接入甘油管中進行保藏。

4、培養方法：從冷凍甘油管中取混菌保藏培養物種液10mL接入發酵培養基(75mL/750mL搖瓶)，30℃，200rpm培養72h，定期取樣測定參數。

5、分析方法

菌體濃度測定：取適量的菌懸液置于10mL容量瓶中，加入等體積2mol·L^-1鹽酸溶解菌懸液中的碳酸鈣，再加入去離子水定容至10mL，搖勻，用UV?7500型可見分光光度計，于660nm處比色測OD值。

滲透壓測定：用冰點滲透壓計測定。

2-KLG與L-山梨糖含量的測定：采用高效液相色譜(HPLC)測定。色譜柱：Aminex?HPX-87H(Bio-Rad)，流動相：0.005mol·L^-1H₂SO₄，流速：0.5mL·min^-1，柱溫：35℃，進樣量：5μL，檢測器：示差折光檢測器。