[發明專利]一株產丙酮酸重組菌的構建及用其提高丙酮酸合成速率的方法

有效

• 申請號: 200910034772.6
• 申請日: 2009-09-09
• 公開（公告）號: CN101691545A
• 公開（公告）日: 2010-04-07
• 發明（設計）人: 劉立明;秦義;陳堅;周景文
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P7/40;C12R1/88
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及一種在T.glabrata線粒體內過量表達來源于莢膜胞漿菌(H.capsulatum)中編碼NADH選擇性氧化酶的AOX1基因，從而實現加速NADH氧化，增加NAD⁺供給，提高T.glabrata對葡萄糖的消耗速率以及丙酮酸生產強度的方法，屬于輔因子代謝調控策略優化發酵過程技術領域。

背景技術

提高糖酵解速度是所有以糖質原料為底物的工業發酵過程共同關心的問題，但糖酵解速率受其關鍵酶活性、細胞內NADH氧化途徑及效率和ATP濃度等條件所控制，其中最為重要的影響因素是NADH氧化途徑及其效率。因為NADH氧化途徑及效率不僅影響糖酵解途徑關鍵酶的反饋抑制物質ATP水平，同時影響糖酵解的底物NAD⁺水平，這兩者的豐度最終影響糖酵解的關鍵酶活性。微生物細胞內NADH主要來源于糖酵解途徑、三羧酸循環以及脂類的代謝。由于NADH/NAD⁺不能穿過線粒體膜，導致細胞質與線粒體中具有不同的氧化途徑將NADH氧化為NAD⁺。在胞質中，NADH主要通過NADH脫氫酶、乙醇脫氫酶、3-磷酸甘油脫氫酶等脫氫酶氧化成NAD⁺；而線粒體內的NADH主要通過電子傳遞鏈氧化成NAD⁺，相應地生成大量ATP。前期研究表明，光滑球擬酵母中高濃度的ATP抑制糖酵解關鍵酶磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶活性，在一定范圍內降低胞內ATP含量能有效地提高糖酵解速度。而改變胞內NADH氧化途徑是降低胞內ATP水平同時提供足量NAD⁺的一種有效策略。

發明內容

本發明目的是提供一株產丙酮酸重組菌的構建及用其提高丙酮酸合成速率的方法，將編碼H.capsulatum中NADH選擇性氧化酶的AOX1基因表達于T.glabrata中，構建一條異源NADH氧化途徑。構建的NADH氧化途徑能有效地將源于NADH的電子流從細胞色素途徑中的泛醌處分流，繞過復合物III和IV，直接由選擇性氧化酶作用生成水，避免電子通過電子傳遞鏈及F₀F₁-ATPase而大量合成ATP導致胞內能荷增加。實現了充分氧化NADH提供糖酵解途徑前體NAD⁺而降低胞內ATP水平的目的，最終有效地提高糖酵解速率和丙酮酸生產強度。

本發明的技術方案：一株產丙酮酸重組菌，其分類命名為光滑球擬酵母(Torulopsis?glabrata)AOX，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC?NO：M209134。

所述的光滑球擬酵母CCTCC?NO：M?209134的構建方法，通過過量表達NADH選擇性氧化酶的手段，根據NCBI網站發表的莢膜胞漿菌(Histoplasmacapsulatum)中的NADH選擇性氧化酶基因的序列，設計一對引物

S：5’-ATCGCCCCATGGTCAGCACTGCCATTACTAATACACCTCACTTCC-3’

A：5’-TACTCGGAGCTCGTTTTGTTTAAGCTGATGCAATTTTTTGCCG-3’；

用于從莢膜胞漿菌總DNA中擴增AOX1基因，然后將其插入穿梭質粒pYX212的TPI-promoter后的多克隆位點中，得到表達質粒pYX212-AOX1，轉化T.glabrata?CCTCC?NO：M202019的尿嘧啶缺陷型菌株，獲得重組菌光滑球擬酵母AOX。

所述T.glabrata?CCTCC?NO：M202019的尿嘧啶缺陷型菌株，即光滑球擬酵母(T.glabrata)CCTCC?M202019，煙酸(NA)、生物素(Bio)、硫胺素(B₁)、吡哆醇(Pdx)等四種維生素營養缺陷型，且丙酮酸脫羧酶活性組成型降低，為本研究室選育菌株，該菌種已申請中國專利，申請號為02113142.2，公開號為CN1392246A。

一種丙酮酸的生產方法，采用光滑球擬酵母CCTCC?M?209134為生產菌株，經種子培養和液體發酵生產丙酮酸；

(1)種子培養

種子和斜面培養基g/L：葡萄糖30，蛋白胨10，KH₂PO₄1，MgSO₄·7H₂O0.5，瓊脂20(斜面培養基)，pH?5.5；