[發(fā)明專利]用RNA干涉降低楊樹木質(zhì)素含量的方法無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 200910032943.1 | 申請日： | 2009-06-09 |
| 公開（公告）號： | CN101603052A | 公開（公告）日： | 2009-12-16 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 項艷;魏國;沈周高;蔡誠;宋恩慧 | 申請（專利權(quán)）人： | 安徽農(nóng)業(yè)大學 |
| 主分類號： | C12N15/84 | 分類號： | C12N15/84 |
| 代理公司： | 南京知識律師事務(wù)所 | 代理人： | 何震花 |
| 地址： | 230036安*** | 國省代碼： | 安徽;34 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | rna 干涉 降低 楊樹 木質(zhì)素 含量 方法 | ||
1.一種用RNA干涉降低楊樹木質(zhì)素含量的方法，從楊樹中克隆CCR基因片段作為RNA干擾片段，以組成型啟動子CaMV35S啟動表達，構(gòu)建含CCR基因正反片段的表達載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將CCR基因的正反結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)入楊樹中，通過抗性植株P(guān)CR檢測和對轉(zhuǎn)基因楊樹進行Klason木質(zhì)素和綜纖維素含量檢測，植株纖維長寬比及細胞壁厚度和組織化學染色測定，檢驗?zāi)康幕虻恼锨闆r和表達情況，獲得了Klason木質(zhì)素含量降低和綜纖維素含量提高的轉(zhuǎn)基因楊樹植株，主要包括以下步驟：
(1)根據(jù)楊樹木質(zhì)素合成途徑中關(guān)鍵酶CCR基因的序列，通過序列比對，確定楊樹木質(zhì)素合成酶基因的特異性RNA干擾序列，根據(jù)干涉序列設(shè)計引物，進行楊樹木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶CCR基因的干涉片段的特異性擴增；
(2)以組成型啟動子CaMV35S啟動表達，構(gòu)建含CCR基因正反片段的植物表達載體；
(3)轉(zhuǎn)化含有目的干涉片段的載體，并將目的干涉片段整合到楊樹基因組中；
(4)對抗性植株P(guān)CR檢測和對轉(zhuǎn)基因楊樹進行Klason木質(zhì)素含量和綜纖維素測定以及植株纖維長寬比及細胞壁厚度和組織化學染色測定；
其特征在于：在所述步驟(1)中，通過同源性搜索和序列比對，確定目的基因片段序列為楊樹CCR基因的第4個外顯子部分序列，即全長CCR基因Genbank?Accession?Number：AJ295838的第2066～2405片段，共340bp。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用RNA干涉降低楊樹木質(zhì)素含量的方法，其特征在于：在所述步驟(2)中，以組成型啟動子CaMV35S啟動表達，把CCR基因正反片段置于啟動子之后，抑制楊樹CCR基因的表達。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用RNA干涉降低楊樹木質(zhì)素含量的方法，其特征在于：在所述步驟(4)中，所述的抗性植株P(guān)CR檢測是通過設(shè)計的CaMV35S特異性引物，進行PCR擴增驗證。?
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