[發明專利]氧化鋅量子點標記抗體的熒光免疫測定方法

有效

• 申請號: 200910032135.5
• 申請日: 2009-07-01
• 公開（公告）號: CN101587071A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發明（設計）人: 谷保祥;徐春祥;劉松琴;王明亮;朱光平
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/53;G01N33/552;G01N1/28
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司
• 代理人: 葉連生

技術領域

本發明屬于免疫測定技術領域，涉及一種利用氧化鋅量子點進行免疫測定的方法。

背景技術

納米結構氧化鋅除了獨特的半導體光電特性之外，還具有對生物安全無毒、能與蛋白質等生物分子以氫鍵或其他方式螯合并能很好的保持其生物活性、具有較高等電點等優異的性能，這使其在生物/化學傳感器方面具有重要的應用。

目前，低濃度抗原的檢測是臨床醫學和診斷學面臨的重要課題。能成功檢測低濃度的抗原，可以為相應的疾病早期診斷和治療提供科學的依據。抗原濃度檢測的傳統手段是先進行病毒培養以提高疾病抗原的濃度，然后輔以光化學檢測法或其他檢測方法確定抗原濃度并推算出原始濃度。這種方法的局限性在于其周期長，精確度差等，可能延誤疾病的發現和最佳治療時機。利用納米材料構建生物/化學傳感器進行電化學檢測抗原的方法因其檢測限低、檢測快速、選擇性好等優點正逐漸受到越來越多的重視，但由于早期疾病期相應抗原的濃度極低，因此如何使低濃度的抗原產生明顯的檢測信號是這種方法亟待解決的重要問題之一。

發明內容

技術問題：本發明針對上述技術缺陷，提供一種氧化鋅量子點標記抗體的熒光免疫測定方法，該方法利用氧化鋅標記抗體檢測低濃度抗原，對相應抗原的檢測限低、選擇性好、靈敏度高、穩定性好。

技術方案：在本發明中，利用簡單的液相反應制備氧化鋅量子點，得到了粒徑均一，分散性好的氧化鋅量子點，把量子點標記到抗體上。同時在自制的電解池中在載片上固定化一層抗體，在特定濃度的待測抗原溶液中，使標記了氧化鋅量子點的抗體和載片上的抗體均與抗原進行特異性結合，把標記在抗體上的氧化鋅量子點連接到載片上。然后測定載片上氧化鋅量子點的熒光強度，建立氧化鋅熒光強度與與抗原濃度之間的關系，從而確定待測抗原濃度。

利用液相反應制備氧化鋅量子點，得到粒徑均一、分散性好的氧化鋅量子點，把該量子點標記到抗體上；同時在電解池中的載片上固定化一層抗體，在一系列已知濃度的待測抗原溶液中，使標記了氧化鋅量子點的抗體和載片上的抗體均與抗原進行特異性結合，把標記在抗體上的氧化鋅量子點連接到載片上；然后測定載片上氧化鋅量子點的熒光強度，建立氧化鋅熒光強度與與抗原濃度之間的標準對應關系，用實際樣品檢測時得到的氧化熒光強度與此標準對應關系相對照即可確定實際樣品的抗原濃度。

本發明的技術解決方案具體為：

第一步：二水合乙酸鋅與乙醇按2∶1～25∶1克/升混合，60～80℃回流2.5～4小時，溶解，冷至室溫；

第二步：一水合氫氧化鋰與乙醇按0.6∶1～6∶1克/升混合，超聲溶解；

第三步：將第一步和第二步所得溶液混合，置于高壓釜中，密封，使其能承受壓力不小于2×10⁵Pa，加熱至60～100℃，保持0.5～3小時，自然冷卻至室溫，取出，離心，用去離子水清洗三次，得到氧化鋅量子點；

第四步：將氧化鋅量子點分散到抗體溶液中，氧化鋅量子點質量與抗體溶液體積比為2.5∶1～25∶1克/升，33～37℃震蕩1～3小時，離心，用pH6.8～7.5磷酸鹽緩沖溶液清洗三次；最終分散于pH6.8～7.5磷酸鹽緩沖溶液中，不用時保存于冰箱保溫層；

第五步：載片修飾，分兩類載片，①金片，浸于等摩爾濃度的5～15毫摩爾/升的11-巰基-十一烷酸(MUA)和11-巰基-十一烷醇(MU)的乙醇溶液中，0～8℃保持18小時，取出用去離子水清洗；②二氧化硅片或玻璃片，浸于5～15毫摩爾/毫升3-胺基-三乙氧基硅丙烷(APTS)的乙醇溶液中，35～45℃保持2～5小時，用去乙醇清洗，再浸于5～15毫摩爾/毫升戊二醛水溶液中1～3小時，取出，用去離子水清洗；

第六步：將第五步得到的載片安裝到自制的電解池中，向電解池中注入抗體溶液，使注入的抗體溶液體積至少能全部浸沒反應液腔內的載片面積且至多不溢出反應液腔，33～37℃保持1～3小時，用pH6.8～7.5磷酸鹽緩沖溶液注入清洗；

第七步：向電解池中注入的抗原溶液，使注入的抗原溶液體積至少能全部浸沒反應液腔內的載片面積且至多不溢出反應液腔，33～37℃保持1～3小時，用pH6.8～7.5磷酸鹽緩沖溶液注入清洗；

第八步：將第四步制得的標記了氧化鋅量子點的抗體溶液注入電解池中，使注入的溶液體積至少能全部浸沒反應液腔內的載片面積且至多不溢出反應液腔，33～37℃保持1～3小時，用pH6.8～7.5磷酸鹽緩沖溶液注入清洗，取出載片，室溫真空干燥2小時；

第九步：測定載片上氧化鋅量子點的熒光強度；