[發(fā)明專利]棉花纖維發(fā)育中兩個(gè)新的microRNA基因與用途

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910029480.3
• 申請(qǐng)日: 2009-04-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101565701A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-10-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊志敏;陳旭升;王芹芹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11
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• 代理人: 暫無(wú)信息

一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及與陸地棉纖維發(fā)育相關(guān)的兩個(gè)未知miRNA(ghr-MIR3和ghr-MIR9)基因的克隆、鑒定和用途。建立了野生型(WT)和無(wú)絨無(wú)絮纖維突變體(M)兩個(gè)小分子RNA文庫(kù)，采用了目前國(guó)際最先進(jìn)的高通量測(cè)序列技術(shù)，獲得了上述兩個(gè)新的miRNA基因序列。進(jìn)一步分析了該miRNA的兩個(gè)靶基因，分別編碼葉綠體omega?3-脂肪酸脫飽和酶和乙醇脫氫酶，兩者分別控制纖維的伸長(zhǎng)發(fā)育及細(xì)胞壁的形成和加厚。本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。若以該miRNA及其靶基因作為目的基因?qū)γ藁ㄟM(jìn)行深入的功能研究，在一定程度上可有效地提高棉纖維的品質(zhì)，具有一定的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益。

二、背景技術(shù)

MicroRNAs(miRNAs)是一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼、長(zhǎng)度約為21nt的單鏈小分子RNA。近年來(lái)的大量研究表明，miRNA在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育，細(xì)胞增值、脅迫響應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。棉花是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，其纖維是天然紡織材料的主要來(lái)源。我國(guó)是世界上最大的棉花生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)，也是一個(gè)重要的棉花貿(mào)易國(guó)，因此，棉花作為經(jīng)濟(jì)作為在我國(guó)更是具有舉足輕重的地位(http://www.emergingtextiles.com)。棉花纖維的發(fā)育機(jī)理成為備受關(guān)注的熱點(diǎn)，因?yàn)樗P(guān)系到如何提高棉纖維產(chǎn)量(提高單位面積棉纖維伸長(zhǎng)的數(shù)量)，改良纖維品質(zhì)，而所有這些是與紡織工業(yè)和民生密切相關(guān)的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外除了利用常規(guī)育種手段外，逐步運(yùn)用基因工程技術(shù)對(duì)棉纖維品質(zhì)進(jìn)行遺傳改良。利用基因工程改良纖維品質(zhì)依賴于對(duì)纖維發(fā)育相關(guān)基因及其調(diào)控元件的認(rèn)識(shí)。因此，開(kāi)展分離、鑒定與棉花纖維發(fā)育相關(guān)的功能基因是培育優(yōu)質(zhì)棉纖維新品種，實(shí)現(xiàn)育種理論和關(guān)鍵技術(shù)新突破的重要基礎(chǔ)，也是提升我國(guó)棉花育種原始創(chuàng)新力的關(guān)鍵舉措。

2007年我們實(shí)驗(yàn)室率先在已有的棉花基因組中挖掘出了37miRNA。這也是國(guó)內(nèi)外迄今為止從棉花植物中發(fā)掘到最多的miRNA。這些重要的miRNA基因?qū)φ{(diào)控棉花生長(zhǎng)及纖維發(fā)育具有重要的生物學(xué)意義及潛在的生產(chǎn)開(kāi)發(fā)價(jià)值。雖然目前已經(jīng)知道與棉纖維發(fā)育相關(guān)的基因有上千個(gè)，但對(duì)這些基因的表達(dá)機(jī)理及網(wǎng)絡(luò)調(diào)控知之甚少。因此，迫切需要對(duì)我國(guó)已有的特色棉花資源，通過(guò)大規(guī)模克隆方法充分挖掘和開(kāi)發(fā)屬于本國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新的miRNA(包括其它sRNA)基因，為后期定向改良和培育優(yōu)質(zhì)性狀的棉花種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

本專利所克隆到的兩個(gè)新的miRNA來(lái)自于陸地棉品種，而且只在突變體中表達(dá)，表明在野生型中這兩個(gè)miRNA不表達(dá)，因此它們不會(huì)對(duì)葉綠體ω-3-脂肪酸脫飽和酶和乙醇脫氫酶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的切割抑制。ω-3-脂肪酸脫飽和酶在植物中催化脂肪酸脫飽和生成三烯脂肪酸，后者對(duì)維持細(xì)胞膜的功能起著重要的作用。更重要的是三烯脂肪酸是茉莉酸合成的前體，而茉莉酸對(duì)細(xì)胞壁的形成有調(diào)節(jié)作用。乙醇脫氫酶在細(xì)胞壁中以眾多的代謝物為底物催化木質(zhì)素的鉸鏈，形成細(xì)胞壁的成分。因此，兩者可能對(duì)纖維細(xì)胞壁的合成有著重要的影響。

事實(shí)上，脂肪酸脫飽和酶和乙醇脫氫酶是多功能酶，這兩種酶參與植物對(duì)冷害脅迫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，基因突變導(dǎo)致植物對(duì)冷脅迫的高度敏感。兩者可能在棉花植物開(kāi)花吐絲后期由于氣溫較低調(diào)節(jié)棉纖維的生伸發(fā)育。但是上述兩個(gè)靶基因在調(diào)節(jié)棉花纖維合成中的具體功能還不清楚。因此，通過(guò)研究miRNA的調(diào)節(jié)功能系統(tǒng)研究脂肪酸脫飽和酶和乙醇脫氫酶在棉花纖維發(fā)育中的作用具有重要的生物學(xué)意義和潛在應(yīng)用價(jià)值。

三、發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是克隆陸地棉纖維發(fā)育過(guò)程中兩個(gè)重要的miRNA(ghr-MIR3和ghr-MIR9)，分析和鑒定了二級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)分析得到了兩個(gè)靶基因，葉綠體ω-3-脂肪酸脫飽和酶和乙醇脫氫酶基因，分析表明它們參與了棉纖維發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞壁的合成。以此基因?yàn)榛A(chǔ)，通過(guò)基因工程的方法改變目前棉纖維的品質(zhì)特性，獲得一定的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益，為棉花的品質(zhì)育種提供基因資源，盡快提高我國(guó)棉花品種的纖維品質(zhì)。

技術(shù)方案

陸地棉pre-ghr-MIR3(基因表達(dá)前體)，長(zhǎng)度為205bp，序列如下：

AACTAATCCTTGTACATTAGATCAAAGAGCAAACTTATCATTTCTATTAAAAACTAACGTGATTGATGGA

TTAACCAGACAGTTACACGTAGCGTGCCACATGTATCTCATTTGAGAGGTAGGCACAAGTTTTTAGCAA