[發明專利]一組基于三疣梭子蟹線粒體D-LOOP基因的微衛星引物

無效

• 申請號: 200910029061.X
• 申請日: 2009-01-17
• 公開（公告）號: CN101519690A
• 公開（公告）日: 2009-09-02
• 發明（設計）人: 董志國;李曉英;閻斌倫;孟學平;程漢良
• 申請（專利權）人: 淮海工學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司
• 代理人: 劉喜蓮

技術領域

本發明涉及基于三疣梭子蟹D-LOOP基因的微衛星引物，可應用于三疣梭子蟹的種質鑒定與評價和遺傳結構分析的微衛星引物。

背景技術

三疣梭子蟹(P.trituberculatus)，俗稱海蟹或大蟹，屬于甲殼綱，十足目，梭子蟹科。它廣泛分布在中國南北沿海，是中國大型海洋經濟蟹類，是沿海重要的漁業資源，開展三疣梭子蟹群體遺傳結構分析和種質鑒定工作，對于三疣梭子蟹的增養殖親本選擇和原種、家系和優良品種資源保護具有重要的應用價值。

目前常用來進行評價生物遺傳多樣性和種質鑒定的分子標記均具有一定程度的缺陷，如RAPD技術(隨機擴增序列多態性DNA，Random?amplifiedpolymorphic?DNA)，常因RAPD引物過短10個堿基、退火溫度過低一般36-37℃，導致擴增產物的一些非特異結果，其可靠程度和真實性是主要的缺陷；而AFLP技術(擴增片段長度多態性，Amplifiedfragment?lengthpolymorphism)，又因操作條件復雜如要求酶切、成本相對較高而限制了其廣泛的應用。微衛星標記是一種新興的分子標記技術，實質就是基因組中大量存在的串聯重復序列，以這些重復序列作為遺傳標記可以進行種質鑒定與標記、遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜的構建等一系列工作，其工作原理是通過已知的基因序列尋找微衛星序列然后在微衛星序列上下游設計特異性引物，這樣設計的引物就成為微衛星引物，通過使用設計好的成對引物就可以通過PCR技術擴增出微衛星標記帶，通過電泳凝膠成像技術成像后進行種質鑒定與標記、遺傳多樣性分析或遺傳連鎖圖譜的構建。應用微衛星引物擴增出的微衛星序列電泳分離時具有單堿基的高分辨率，遺傳信息量大，通常為顯性標記，呈孟德爾式遺傳，具有很高的穩定性和多態性，且DNA用量較AFLP少，技術要求低，微衛星標記技術則正好克服了RAPD和AFLP技術的這些缺點，具有很好的應用價值。

線粒體DNA為細胞核外遺傳物質，且以母性遺傳為主，具有結構簡單、堿基突變率高、核苷酸歧義度大和進化速度快等特點，特別適宜種質鑒定和遺傳結構分析。D-LOOP俗稱D環，又稱線粒體控制區，具有較高的變異水平，特別適合于種以下水平的遺傳分析和親緣關系鑒定，目前，D-LOOP作為分子標記在種質資源評價和群體結構分析中被認為是最廣泛的基因之一。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，開發一組基于三疣梭子蟹線粒體D-LOOP基因的微衛星引物，該引物可克服現有技術引物過短，退火溫度低，操作條件復雜，成本高、準確性低的缺陷。

本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一組基于三疣梭子蟹線粒體D-LOOP基因的微衛星引物，其特點是，所述的微衛星引物為：

D-LOOP78DY1：?F：AAGGCCTACATACAAAGAGC

??????????????R：ACTAAGTGAAGAATGAGATA

D-LOOP91DY4：?F：TATATCTAATTCTTCACTT

??????????????R：AACTATCTAATTACTGTCTT

D-LOOP125DY4：F：CAAAACTAATTCCTATAAACTAAA

??????????????R：AACCAAAGCATTCCCTGAG

D-LOOP52L2：??F：TTTGAGAATAAGATGATAGG

??????????????R：AACGGGAGAATAAGATGAAA

D-LOOP229L13：F：TGGAGTTCCTATTTCATCTTATT

??????????????R：TCACTTTCTTCCTTTGCTCAT

D-LOOP150DY2：F：TTTCTTCCTTTACTCATTA

??????????????R：CTATTTCATCTTATTCTGTCGTT

D-LOOP135DY2：F：TACTAGTATATCGTTTA

??????????????R：ATTTTGTATATTTAGGTG

D-LOOP225DY2：F：TCGTTTTATTGATTATT

??????????????R：AAAAAGTTGAAAGAGTA

上述微衛星引物可通過以下方法得到，

(1)采集三疣梭子蟹活體運回實驗室提取總DNA，通過PCR擴增三疣梭子蟹的D-LOOP基因，將PCR產物進行雙向測序；