[發明專利]一種匍匐型地被菊遺傳轉化的方法

有效

• 申請號: 200910028638.5
• 申請日: 2009-01-07
• 公開（公告）號: CN101451140A
• 公開（公告）日: 2009-06-10
• 發明（設計）人: 陳發棣;崔新利;陳素梅;房偉民;繆恒彬;姜貝貝;管志勇;劉兆磊;滕年軍
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司
• 代理人: 張素卿

1.一種匍匐型地被菊遺傳轉化的方法，包括：

1)無菌苗的獲得

于秋末取匍匐型地被菊腳芽，洗滌劑清洗15min，流水沖洗2h，濾紙吸干水分，無菌條件下依次用體積比為70％的乙醇浸泡30s，質量百分比為0.1％的升汞溶液消毒6min，無菌水沖洗4次，切取0.5cm帶腋芽的莖段，接種于MS+細胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+生長素NAA?0.1mg·L^-1培養基上誘導腋芽萌發，不定芽長至2cm時切下轉入生根培養基1/2MS+生長素NAA?0.1mg·L^-1獲得無菌苗；

2)農桿菌懸浮液制備

菊花‘鐘山紅楓’DREBa基因的克隆、植物表達載體構建與農桿菌轉化

①DREBa基因克隆與連接

以菊花品種‘鐘山紅楓’RNA為模板進行RT-PCR擴增合成DREBa基因的cDNA開放閱讀框ORF，擴增引物如下：

BamH?I

正向引物：5’-CGCGGATCCATGGATATCGAATCACACTAC-3’

Kpn?I

反向引物：5’-CGGGGTACCTCACTAAGAACACCACAACGA-3’

用瓊脂糖凝膠電泳回收純化以上RT-PCR目的產物片段872bp，與T-載體連接后轉化大腸桿菌DH5α感受態，進行LB+50mg·L^-1氨芐青霉素平板培養，培養條件為37℃和16h，挑取白色克隆接種于LB培養基進行液體培養，培養條件為37℃和16h，提取含有DREBa基因片段的T-載體質粒，測序驗證；

②pCAMBIA1301-DREBa植物表達載體構建與DH5a轉化

用BamH?I和Kpn?I雙酶切連接到T-載體的DREBa基因，電泳回收目的片段，與用BamHI和Kpn?I雙酶切過的植物表達載體pCAMBIA?1301連接，轉化大腸桿菌DH5a感受態，挑取陽性克隆接種于LB培養基進行液體培養，培養條件為37℃和16h，提取質粒，BamHI和KpnI雙酶切鑒定pCAMBIA1301-DREBa重組質粒；

③pCAMBIA1301-DREBa植物表達載體農桿菌轉化與鑒定

pCAMBIA1301-DREBa重組質粒采用液氮冷凍法轉化農桿菌LBA4404感受態菌株，于YEP+50mg·L^-1卡那霉素+50mg·L^-1利福平固體培養基劃板培養，培養條件為28℃和48h，挑取單克隆于YEP+50mg·L^-1卡那霉素+50mg·L^-1利福平液體培養基震蕩培養，培養條件為28℃和12h，震蕩速度200r·min^-1，采用堿裂解法提取重組質粒并進行雙酶切檢測，經酶切驗證含有pCAMBIA1301-DREBa重組質粒的農桿菌菌液則可用于下一步的葉盤侵染。添加終濃度體積比20％的甘油至農桿菌菌液，-80℃長期保存；

將-80℃保存的農桿菌菌液常溫化凍后于YEP+50mg·L^-1卡那霉素+50mg·L^-1利福平固體培養基劃板培養，培養條件為28℃和48h，挑取單克隆接種于30ml?YEP+50mg·L^-1卡那霉素+50mg·L^-1利福平液體培養基震蕩培養，培養溫度為28℃，震蕩速度200r·min^-1，至農桿菌長至對數生長期即OD₆₀₀為0.5時，將菌液倒入無菌離心管中，4000rpm離心10min，收集菌體沉淀，用等量30ml?MS液體培養基重懸，備用；

3)遺傳轉化體系建立

在超凈工作臺上，25天苗齡的無菌苗頂端2-4片幼嫩葉片切成5mm²大小，在黑暗條件下進行下述培養：在MS+細胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+生長素NAA1.0mg·L^-1培養基上預培養3d，在上述制備的農桿菌懸浮液中侵染10min，用無菌濾紙吸干葉面菌液，放置于MS+細胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+生長素NAA1.0mg·L^-1上25℃共培養3d，轉入脫菌培養基MS+細胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+生長素NAA1.0mg·L^-1+羧芐青霉素Carb350mg·L^-1上脫菌培養3d，然后轉入篩選培養基MS+細胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+生長素NAA1.0mg·L^-1+潮霉素Hyg8mg·L^-1+羧芐青霉素Carb250mg·L^-1上培養至誘導出愈傷組織，之后轉入低選擇壓的篩選培養基MS+細胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+生長素NAA1.0mg·L^-1+潮霉素Hyg6mg·L^-1+羧芐青霉素Carb150mg·L^-1上繼續培養至萌發不定芽點，以上黑暗培養時溫度均為26±2℃，共培養時除外；

切取帶有不定芽點的愈傷塊轉入不加抗生素的再生培養基MS+細胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+生長素NAA1.0mg·L^-1上，在溫度為26±2℃，光照時間為16h·d^-1的條件下培養，待不定芽長至2.0cm時，切下不定芽轉入生根篩選培養基1/2MS+生長素NAA?0.1mg·L^-1+潮霉素Hyg7mg·L^-1，獲得具有潮霉素抗性的生根苗，將生根苗轉入1/2MS+生長素NAA0.1mg·L^-1培養基中正常生根；

4)轉基因植株的獲得

待抗性植株長出8-10片葉時，取其嫩葉，采用CTAB法提取基因組DNA，根據潮霉素磷酸轉移酶基因HPT兩端序列合成擴增反應引物Hyg-F正向序列和Hyg-R反向序列

Hyg-F：5′-CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3′

Hyg-R：5′-TACTTCTACACAGCCATC-3′

以抗性植株的DNA為模板，以Hyg-F和Hyg-R為引物，進行PCR擴增，PCR鑒定結果顯示抗性植株擴增出一條清晰的條帶950bp，與潮霉素磷酸轉移酶基因HPT核苷酸序列一致，證實外源基因已轉入地被菊基因組DNA中，獲得轉基因植株。