[發(fā)明專利]異檸檬酸測定試劑(盒)及異檸檬酸濃度測定方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910028535.9
• 申請日: 2009-02-04
• 公開（公告）號: CN101793770A
• 公開（公告）日: 2010-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王爾中
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/33
• 分類號: G01N21/33;G01N35/00;C12Q1/32;C12Q1/26;C12Q1/00
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種異檸檬酸測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定異檸檬酸濃度的方法，屬于食品檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

異檸檬酸isocitric?acid是檸檬酸的異構(gòu)體，雖然量少，但廣泛存在于生物界。在落地生根屬(Bryophyllum)等多汁植物的葉、或懸鉤子類中特別多，生物能夠利用的是D型。是三羧酸循環(huán)中的一個成分。檸檬酸在鳥頭酸酶的作用下可逆地生成異檸檬酸和順鳥頭酸。在異檸檬酸脫氫酶(EC?1.1.1.41；EC?1.1.1.42)的作用下變成α-酮戊二酸，在異檸檬酸裂合酶(isocitrate?lyase，EC4.1.3.1)的作用下變成琥珀酸與乙醛酸。

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)，GB?T16771-1997，規(guī)定了橙、柑、桔汁及其飲料中D-異檸檬酸的測定方法-紫外分光光度法。該方法適用于判定橙、柑、桔濃縮汁和果汁，以及果汁含量不低于2.5％的橙、柑、桔汁飲料的總D-異檸檬酸的測定。其測定原理：異檸檬酸脫氫酶isocitrate?dehydrogenase有兩種類型：以NAD為輔酶的酶(EC1.1.1.41)和要NADP為輔酶的酶(EC1.1.1.42)，兩者催化同一反應(yīng)。

在異檸檬酸脫氫酶催化下，樣品中的D-異檸檬酸鹽與NAD或NADP作用，生成NADH或NADPH的含量，相當(dāng)于D-異檸檬酸鹽的量。在波長340nm處測定吸光度，確定樣品中總D-異檸檬酸的含量。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提出一種利用酶倍增法(Enzymatic?DoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic?Colorimetric?Method)及酶(偶)聯(lián)法(CoupleReaction)技術(shù)，計量/連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定異檸檬酸濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的異檸檬酸測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行異檸檬酸濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。

本發(fā)明異檸檬酸濃度測定方法如下：

異檸檬酸+輔酶?異檸檬酸脫氫酶?二氧化碳+酮戊二酸+還原型輔酶

二氧化碳+乙酰-輔酶A+還原型鐵氧還蛋白?丙酮酸合成酶丙酮酸+輔酶A+氧化型鐵氧還蛋白

2輔酶A+輔酶?輔酶A-二硫還原酶?輔酶A-二硫+還原型輔酶

這種方法應(yīng)用異檸檬酸脫氫酶(isocitrate?dehydrogenase；EC?1.1.1.41；EC1.1.1.42)酶(偶)聯(lián)丙酮酸合成酶(pyruvate?synthase；EC?1.2.7.1)、輔酶A-二硫還原酶(CoA-disulfide?reductase；EC?1.8.1.14)酶促反應(yīng)比色終點法。異檸檬酸脫氫酶酶解異檸檬酸反應(yīng)產(chǎn)生二氧化碳，再通過(偶)聯(lián)合丙酮酸合成酶、輔酶A-二硫還原酶的作用，最終二次將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，通過測量340nm處吸光度上升的程度，可以測算異檸檬酸的濃度大小。

實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明異檸檬酸測定試劑(盒)較為理想：

緩沖液?????????????????????????????100mmol/L

穩(wěn)定劑?????????????????????????????500mmol/L

輔酶???????????????????????????????3mmol/L

異檸檬酸脫氫酶?????????????????????10000U/L

丙酮酸合成酶???????????????????????12000U/L

輔酶A-二硫還原酶???????????????????12000U/L

乙酰輔酶A??????????????????????????7mmol/L

還原型鐵氧還蛋白???????????????????12mmol/L

本發(fā)明的異檸檬酸測定試劑(盒)可以是單劑，包括：