[發明專利]單胺氧化酶診斷試劑(盒)及單胺氧化酶活性濃度測定方法

無效

• 申請號: 200910028202.6
• 申請日: 2009-02-04
• 公開（公告）號: CN101793690A
• 公開（公告）日: 2010-08-04
• 發明（設計）人: 王爾中
• 申請（專利權）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/33
• 分類號: G01N21/33;G01N35/00;C12Q1/26;C12Q1/32
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技術領域

本發明涉及一種單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，同時本發明還涉及測定單胺氧化酶活性濃度的方法，屬于醫學檢驗測定技術領域。

背景技術

現有技術中，測定單胺氧化酶(MAO)活性的方法主要有：熒光法、免疫抑制法和化學分光光度法。熒光法是以β-苯乙胺作為底物來檢測單胺氧化酶，其依據是：β-苯乙胺在10～100mg時反應速度最大，高于芐胺和5-羥色胺的反應速度。免疫學方法則利用單胺氧化酶抗體與單胺氧化酶發生反應，測定反應后形成的單胺氧化酶同工酶，目前應用較多的單克隆抗體有MAO-A3C9、MAO-A4F10、MAO-A7B10、MAO-A7E10和MAO-B1C2等。

相對而言，化學分光光度法應有更為普遍。可以用單胺氧化酶催化胺類釋放出的過氧化氫(H₂O₂)去氧化10-N-甲基氨基甲酰基-3，7-二甲氨基-10-氫-吩噻嗪(MCDP)等發色劑進行測定，也可以應用芐胺(Benzylamine)、對苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine)、β-苯乙基胺(b-phenylethylamine)、酪胺(tyramine，又稱“3-對羥基苯乙胺”，3-parahdroxyphenylethylamine)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine)等作為反應底物來測定單胺氧化酶的活性。其中，應用苯甲胺類型底物測得的單胺氧化酶的活性比其它底物高，而用丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺作底物測得的活性約為3-對羥基苯乙胺作底物的30％。目前，單胺氧化酶測定多用芐胺和對苯甲胺-β-偶氮萘酚作為底物。芐胺法的原理是芐胺在單胺氧化酶的作用下生成芐醛，然后在強堿性氫氧化鈉的條件下與二硝基苯肼反應，生成醛苯腙，這在生化儀上測定較困難；對苯甲胺-β-偶氮萘酚方法則需要用環乙烷提取，限制了該方法的實用性，且不能應用全自動生化儀分析。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric?Method)及酶(偶)聯法(Couple?Reaction)技術，連續監測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定單胺氧化酶活性濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，采用該試劑(盒)不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行單胺氧化酶活性濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。

本發明單胺氧化酶活性濃度測定方法如下：

胺類化合物+水+氧單胺氧化酶相應醛類產物+氨+過氧化氫

過氧化氫+二氧化碳+乙酰輔酶A??丙酮酸氧化酶丙酮酸+輔酶A

+氧

輔酶A+3-甲酰乙酸+輔酶丙二酸-半醛脫氫酶二氧化碳+

乙酰-輔酶A+還原型輔酶

這種方法應用單胺氧化酶(Monoamine?Oxidase；EC?1.4.3.4；EC?1.4.3.6)酶(偶)聯丙酮酸氧化酶(pyruvate?oxidase(CoA-acetylating)；EC?1.2.3.6)、丙二酸-半醛脫氫酶(malonate-semialdehyde?dehydrogenase；EC?1.2.1.18)酶促反應連續監測法。單胺氧化酶酶解胺類化合物反應產生過氧化氫，再通過(偶)聯合丙酮酸氧化酶、丙二酸-半醛脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量340nm處吸光度上升的速度，可以測算單胺氧化酶的活性濃度大小。

實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明單胺氧化酶診斷/測定試劑較為理想：

緩沖液????????????????100mmol/L

穩定劑????????????????500mmol/L

輔酶??????????????????3mmol/L

丙酮酸氧化酶??????????12000U/L

丙二酸-半醛脫氫酶?????10000U/L

胺類化合物????????????5mmol/L

碳酸氫鈉??????????????12mmol/L