[發明專利]一種耐有機溶劑蛋白酶及其產生菌株

有效

• 申請號: 200910027809.2
• 申請日: 2009-05-15
• 公開（公告）號: CN101586086A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發明（設計）人: 何冰芳;吳斌;萬茂華;柏中中;姚忠
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/52;C12N15/57;C12R1/425
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司
• 代理人: 王荷英

技術領域

本發明涉及一種耐有機溶劑蛋白酶產生菌株以及該耐有機溶劑蛋白酶，屬于微生物學與酶學領域。?

背景技術

蛋白酶廣泛應用于洗滌劑、食品、制藥、制革、診斷試劑、污水處理等領域。1984年，Klibanov等人發現蛋白酶在一些有機溶劑中保存較長時間仍然具有活性，而且可以催化合成肽鍵的反應。這一發現促進了非水酶學的興起。大量研究表明，有機溶劑中進行酶促反應有許多優點，如有機底物的溶解性大大增強、酶的穩定性提高、防止微生物污染、產物易純化等。更重要的是，在有機溶劑中利用蛋白酶催化合成肽，可以避免氨基酸的外消旋作用，不需要對氨基酸側鏈進行保護及脫保護，因此降低成本。研究表明，只有當酶分子具有一定的構象時，才能表現出催化活力。水直接或間接地參與維持酶分子構象的非共價作用力，維持酶的活性構象變化所需的“柔性”。因此，有機溶劑尤其是親水性有機溶劑對天然來源的蛋白酶分子的催化活性影響很大。為了改善酶在有機溶劑中的穩定性，人們采用各種方法如酶的定向進化或化學修飾、固定化等策略。但是效果并不能滿足實際催化的需要。?

耐有機溶劑極端微生物能在富含有機溶劑的環境中生存，因此其所產胞外蛋白酶很有可能具有一定的有機溶劑耐受性。在已報道的有機溶劑耐受性微生物中以革蘭氏陰性菌為主，僅有少量文獻報道了具有有機溶劑耐受性的革蘭氏陽性菌如Bacillus(芽孢桿菌屬)，Rhodococcus(紅球菌屬)和Arthrobacter(節桿菌屬)等。目前已報道的產溶劑穩定性蛋白酶的微生物多為Pseudomonas(假單胞菌屬)菌株。國內關于耐有機溶劑微生物產蛋白酶的相關報道并不多。其中也未見Serratia?marcescens產耐有機溶劑蛋白酶的報道。?

發明內容

本發明的目的是提供一種具有優良有機溶劑耐受性能的蛋白酶及其產生菌株。?

本發明提供一種具有有機溶劑耐受性的沙雷氏菌屬菌株，命名為Serratiamarcescens?MH6，保藏單位：中國典型培養物保藏中心(湖北省武漢市武漢大學)，保藏日期2008年11月7日，其保藏登記號為：CCTCCNO：M208205。?

菌株Serratia?marcescens?MH6為耐有機溶劑蛋白酶產生菌。篩選過程如下：?

初篩：采用不同濃度環己烷、DMF、DMSO等有機溶劑為篩選壓力從油污土樣中篩選獲得耐有機溶劑極端微生物。然后，采用牛奶瓊脂平板培養基，從上述耐有機溶劑極端微生物中篩選蛋白酶產生菌株，共獲得6株蛋白酶高產菌。?

復篩：通過檢測各菌株產蛋白酶能力及所產蛋白酶的有機溶劑耐受性，從初篩菌中選取具有優良有機溶劑耐受性能的蛋白酶的產生菌。菌株MH6產蛋白酶能力最強，活力高達1204U/mL；該菌株的粗酶液具有優良有機溶劑耐受性能因此，最終選擇菌株MH6作為耐有機溶劑蛋白酶產生菌。?

菌株MH6經過BIOLOG自動細菌鑒定儀鑒定和16S?rDNA序列分析，表明該菌株屬于沙雷氏菌屬，為Serratia?marcescens，并命名Serratia?marcescens?MH6。?

菌株Serratia?marcescens?MH6為革蘭氏陰性短桿菌株，無芽孢，周生鞭毛，菌落為紅色，大小為1μm×1.5～0.7×1.0μm。在LB培養基中生長24小時后，菌落大小為1.5～2.5mm。該菌株生長溫度范圍為20～45℃，最適生長溫度為35℃，生長pH為5～9，最適pH為8.0，在有氧條件下生長。?

本發明對菌株Serratia?marcescens?MH6產生的耐有機溶劑蛋白酶進行了純化：(1)硫酸銨沉淀法初步純化耐有機溶劑蛋白酶。將粗酶液置于冰浴中，加入50％飽和度的(NH₄)₂SO₄沉淀雜蛋白，然后向上清液中加入(NH₄)₂SO₄至飽和度60％，獲得沉淀。經檢測，沉淀中的蛋白酶活力回收達到69.1％。(2)離子交換層析法進一步純化耐有機溶劑蛋白酶。通過SDS-PAGE電泳分析，表明：經過兩步純化，該蛋白酶已經達到電泳純，其亞基分子量約為52～54kDa；最終，蛋白酶純化倍數(表3)為5.98，回收率為19.87％，比活達到42388.57U/mg。該耐有機溶劑蛋白酶，基于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳的分子量為?52-54KDa。?