[發明專利]一種檢測重組雞痘病毒活疫苗空斑的染色計數方法

無效

• 申請號: 200910027291.2
• 申請日: 2009-05-27
• 公開（公告）號: CN101566579A
• 公開（公告）日: 2009-10-28
• 發明（設計）人: 甘軍紀;劉秀梵;彭大新
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: G01N21/88
• 分類號: G01N21/88;G01N1/30
• 代理公司: 南京知識律師事務所
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及疫苗的制造與檢驗，具體涉及一種檢測重組雞痘病毒活疫苗空斑的染色計數方法。

背景技術

近年來，重組雞痘病毒活疫苗研制已成為疫苗研制的熱點，許多國家已有產品獲準生產。在我國禽流感重組雞痘病毒活疫苗已上市，還有多個產品處于臨床試驗階段。常用的雞痘病毒活疫苗空斑形成單位(PFU)計數方法多以瓊脂覆蓋法或顯微鏡下直接計數法進行。瓊脂覆蓋法操作繁瑣，影響因素多，空斑出現遲；顯微鏡下直接計數時常常因為空斑不典型，特別是孔板或培養瓶邊緣的空斑難以確認，或有細胞團塊干擾，造成計數不準確。因此，在重組雞痘病毒活疫苗制造和檢驗中，迫切需要一種簡易、快速、準確的檢測疫苗病毒PFU的方法。

技術內容

為了克服現有重組雞痘病毒活疫苗空斑計數方法操作繁瑣、計數不準確的不足，本發明提供一種重組雞痘病毒活疫苗空斑的染色計數方法，有效地解決了問題。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種重組雞痘病毒活疫苗空斑的染色計數方法，是將重組雞痘病毒活疫苗10倍系列稀釋，接種24孔培養板培養的次代CEF，每個稀釋度接種3孔，72h終止培養，吸去培養液，加2mL/L戊二醛固定液固定15min，吸去固定液，加500ug/ml?X-gal染色液染色，37℃培養箱過夜(或8-12小時)。取出培養板放倒置顯微鏡下計數藍染的空斑，計算疫苗病毒含量(PFU)。

由于近幾年研制的重組雞痘病毒活疫苗，插入的篩選標記基因一般都選擇LacZ基因(表達β-半乳糖苷酶)，本研究利用重組雞痘病毒攜帶LacZ標記基因特點，建立了用X-gal直接進行病毒空斑染色計數PFU的方法。本方法可適用于所有選擇LacZ基因作為標記基因的重組雞痘病毒活疫苗的PFU檢測。

X-gal染色原理是X-gal被重組雞痘病毒表達的β-半乳糖苷酶裂解成半乳糖和5-溴-4-氯-3-羥基吲哚，5-溴-4-氯-3-羥基吲哚然后被氧化成5，5’-二溴-4，4’-二氯-靛藍(藍色產物)。

本發明的有益效果是，X-gal染色計數法，細胞培養終止時間為72h，而常規的瓊脂覆蓋法計數空斑要5～6天。染色計數法計數時，培養板邊緣空斑染色清楚，染色的藍色空斑與背景對比清晰，識別容易，使得PFU計數快速而準確。

附圖說明

圖1是X-gal染色的rFPV-11SH5A空斑(100×)

A.接種72h，染色的空斑。

B.位于孔板邊緣的染色空斑。

C.接種48h，空斑染色細胞少

圖2是兩種PFU計數方法的計數結果

具體實施方式

在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。

下面結合具體的實施例，并參照數據進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。

在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現時標明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內容相同。

重組雞痘活疫苗(rFPV-11SH5A)：(陳素娟，孫蕾，石火英，彭大新，劉秀梵；《禽流感病毒H5亞型主要保護性抗原在禽痘病毒中的高效表達》中國獸醫學報，2007，27(2)：200-2002)

實施例1.表達禽流感HA基因重組雞痘活疫苗(rFPV-11SH5A)的檢測。取實驗室制備的8批次rFPV-11SH5A疫苗細胞苗，分別進行染色計數法計數和直接計數法計數。

染色計數法計數：rFPV-11SH5A疫苗細胞苗10倍系列稀釋，各取100ul?10^-4～10^-6稀釋度的病毒，接種到24孔培養板培養的次代雞胚成纖維細胞(CEF)上，每個稀釋度接種3孔，吸附2h，加維持液，37℃CO2培養箱，72h終止培養，吸去培養液，加2mL/L戊二醛固定液固定15min，吸去固定液，加500ug/ml?X-gal染色液染色，37℃培養箱過夜(或8-12小時)。取出培養板放倒置顯微鏡下計數藍染的空斑。培養板邊緣空斑染色清楚，染色的藍色空斑與背景對比清晰，識別容易，見圖1。

染色計數法計數的PFU數是直接計數法的1.6-3.3倍，見圖2。